O tratamento de feridas crônicas é um grande desafio para a saúde pública na atualidade. Devido à complexidade do processo de cicatrização, envolvendo respostas inflamatórias, de proliferação celular e reconstituição do tecido epitelial, o mercado carece de medicamentos que aliem proteção e modulação desse processo para que as feridas cicatrizem adequadamente. Dentre as diversas estratégias estudadas para modular a cicatrização estão a administração prolongada de peptídeos com ação anti-inflamatória e de proliferação celular, a estimulação elétrica e a aplicação de curativos que protejam a ferida contra infecções e perda de fluidos. O objetivo deste trabalho foi associar, de forma racional, essas estratégias em um único sistema de liberação e verificar sua influência na modulação do processo de cicatrização. Para tanto, filmes de fibroína da seda (FS) carreadores de neurotensina (NT) foram desenvolvidos de forma a sustentar a liberação da NT, proteger a ferida e ainda permitir a aplicação de uma corrente elétrica constante e de baixa intensidade, conhecida como iontoforese. Filmes de FS contendo NT (FS-NT) e glicerina como plastificante foram obtidos por evaporação de solvente. Filmes bilaminados contendo um eletrodo de prata também foram preparados para a aplicação da iontoforese. Os filmes apresentaram-se homogêneos, transparentes, permeáveis ao vapor de água, com baixa capacidade de intumescimento e elevada resistência mecânica. Análises de espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier e calorimetria diferencial sugeriram uma maior organização das fibras de FS do filme em conformação de folhas-β/Seda II. A ocorrência de interações não-covalentes entre NT e FS, capazes de estabilizar a estrutura do filme, foi sugerida por essas análises e confirmada por calorimetria de titulação isotérmica. Assim, o filme de FS-NT sustentou a liberação da NT por até 72 h. Quando aplicada, a iontoforese promoveu uma rápida e alta liberação do fármaco do filme, observada por MALDI imaging. Análises por microscopia de força atômica mostraram que na presença do fármaco os filmes apresentaram-se mais rugosos, sugerindo maior aderência ao tecido. Estudos in vitro em cultura de macrófagos, fibroblastos e queratinócitos mostraram que tanto os filmes quanto a iontoforese não apresentaram efeitos citotóxicos. Ainda em cultura de macrófagos, foi possível observar que os filmes de FS-NT reduziram significativamente a produção de interleucina 6 e fator de necrose tumoral alfa, o que não foi observado para a solução de NT. A aplicação da iontoforese modulou a secreção dessas citocinas em função do sistema de liberação. A iontoforese anódica, mas não a catódica, foi capaz de inibir o crescimento de bactérias Gram positivas e fungo, mas não teve influência no crescimento de bactérias Gram negativas. In vivo, em feridas crônicas induzidas em ratos diabéticos, os filmes de FS protegeram as feridas e suportaram o crescimento de células. Os filmes de FS-NT sustentaram a liberação da NT, modulando a expressão de mediadores pró-inflamatórios, a ativação de macrófagos, de miofibroblastos e de queratinócitos. Associados a iontoforese, os filmes reduziram significativamente a expressão de citocinas pró-inflamatórias, modularam a ativação de neutrófilos e macrófagos, estimularam a angiogênese e a proliferação de fibroblastos. No entanto, quando aplicada na etapa final do processo de cicatrização, principalmente associada a NT, a iontoforese parece ter estimulado excessivamente a proliferação de queratinócitos, sugerindo que seja aplicada apenas na primeira semana do tratamento. A aplicação do filme de FS-NT durante todo o período de cicatrização parece ser importante para a manutenção da modulação desencadeada pela aplicação inicial da iontoforese. Desta forma, os filmes de FS-NT elétrico-estimulados desenvolvidos apresentam-se como uma estratégia promissora para o tratamento tópico de feridas crônicas.

The treatment of chronic wounds is still a major public health challenge. Due to the complexity of the healing process, which involves inflammatory responses, cell proliferation and epithelial tissue reconstitution, the market still lacks dressings that combine wound protection and modulation of these processes for proper wounds healing. Strategies that have been studied to modulate wound healing includes the sustained administration of peptides that possess anti-inflammatory and cell proliferating properties, electrical stimulation and application of dressings that protect the wound against infection and fluid loss. The aim of this work was to associate, rationally, these strategies into a single delivery system and verify its influence on the modulation of the wound healing process. To achieve this purpose, neurotensin (NT)-loaded silk fibroin (FS) films were developed to support the release of NT, protect the wound and allow the application of a constant and low intensity of electric current known as iontophoresis. FS films containing NT (FS-NT) and glycerine as plasticizer were developed by film casting, while bi-laminated films containing a silver electrode were also prepared for iontophoresis application. The films were homogeneous, transparent, water vapor permeable, and has low swelling capacity and high mechanical resistance. Fourier transform infrared spectroscopy and differential scanning calorimetry analysis suggested a greater organization of the FS film's fibers into β-sheet/Silk II conformation. The occurrence of non-covalent interactions between NT and FS capable of stabilizing the film structure was suggested by these analyzes and confirmed by isothermal titration calorimetry. FS-NT film sustained the release of NT for up to 72 h, iontophoresis application promoted a fast and high release of NT from the film as observed by MALDI imaging. Atomic force microscopy showed that in the presence of NT, films were rougher, suggesting greater adherence to film structure. In vitro studies in macrophages, fibroblasts and keratinocytes showed no cytotoxic effects of the films and iontophoresis. However, FS-NT films significantly reduced interleukin-6 and α-TNF production in macrophages as compared to NT solution. Iontophoresis application modulated the secretion of these cytokines as a function of the delivery system. Anodic, but not cathodic iontophoresis inhibited the growth of Gram positive bacteria and fungus, but had no influence on the growth of Gram negative bacteria. In vivo, in diabetic rat-induced chronic wounds, FS films protected the wounds and supported cell growth. FS-NT films supported NT release by modulating the expression of proinflammatory mediators, macrophages, myofibroblasts and keratinocytes activation. When FS-NT was associated with iontophoresis, the films significantly reduced proinflammatory cytokine expression, modulated neutrophil and macrophage activation, stimulated angiogenesis and fibroblast proliferation. However, when applied in the final stage of the healing process, especially in association with NT, iontophoresis appears to have excessively stimulated keratinocyte proliferation suggesting that its application may be more beneficial in the early stage rather than the later stages of wound healing. The application of FS-NT film throughout the healing period seems to be important for maintaining the modulation triggered by the initial application of iontophoresis. Thus, the developed electric-stimulated FS-NT film is a promising strategy for the topical treatment of chronic wounds.