Glioblastomas (GBM) são astrocitomas grau 4 e apresentam sobrevida média de 15 meses após o diagnóstico mesmo como tratamento padrão que consiste na ressecção cirúrgica, radioterapia e quimioterapia com temozolamida (TMZ). Previamente, nosso grupo reportou o aumento da expressão de receptores do tipo Toll (TLR) de membrana plasmática em GBMs, especialmente no subtipo mesenquimal (MES), que apresenta o pior prognóstico. TLR4 é um receptor do sistema imunológico responsável em reconhecer moléculas associadas a patógenos e a dano. Diferentes vias de sinalização são descritas para o TLR4 que podem ser pró-sobrevivência ou prómorte. O objetivo principal deste trabalho foi a análise da sinalização do TLR4 em células de GBM e explorar possíveis alvos terapêuticos. Inicialmente confirmou-se a presença de TLR4 em astrocitomas humanos e nas linhagens celulares de GBM do subtipo MES, U87MG e A172. O tratamento com lipossacarídeo (LPS), ativador clássico da via TLR4, levou a translocamento para o núcleo tardio do NF-B, um dos principais fatores de transcrição da via do TLR4, com aumento da expressão de IL1B e genes relacionados ao reparo do DNA. Observou-se ainda aumento da expressão de genes associados a vias não canônicas do TLR4, inflamassomo e ripoptossomo, que foram validados em análise in silico em banco de dados públicos do Atlas do Genoma do Câncer (TCGA). O tratamento combinado com LPS+TMZ aumentou a apoptose das células U87MG, no entanto, houve um incremento significativo maior da morte celular com o acréscimo de inibidor do reparo do DNA, anti-RAD51 / Amuvatinib, em comparação a cada tratamento único. A seguir, o efeito combinado de LPS com metformina (MET) foi analisada em U87MG e A172 por RNASeq. MET é um medicamento conhecido para tratamento de diabetes e inibi o complexo I da fosforilação oxidativa e também pode causar uma resposta anti-inflamatória, incluindo diminuição da ativação do NF-B. MET levou à diminuição da viabilidade celular e estresse mitocondrial em ambas linhagens. Na U87MG, LPS+MET aumentou a expressão de genes pró-apoptóticos e diminuiu de genes pró-sobrevivência e o tratamento combinado LPS+MET+TMZ aumentou significativamente a apoptose das células tumorais. Já nas células A172, com aumento da expressão de genes antioxidantes, o nível de apoptose do tratamento combinado foi muito similar ao tratamento só com TMZ. No entanto, o tratamento com MET diminui a expressão de genes relacionados a segregação cromossômica, o que foi compatível com a parada do ciclo celular observado após tratamento MET+TMZ. O aumento da expressão de genes de anti-oxidação, especialmente SOD1 foi validado in silico nos dados de TCGA no subtipo mitocondrial (MTC), com perfil de expressão similar à linhagem A172. A ativação da via TLR4 foi confirmada no subtipo glicolítico/plurimetabólico (GPM), compatível com perfil de expressão da linhagem U87MG. Os resultados do presente estudo sugerem que os GBM-GPM são elegíveis ao tratamento com MET e a associação com inibidores de reparo do DNA poderá incrementar a morte da célula tumoral, enquanto os GBM-MTC poderão se beneficiar com tratamento combinado com inibidores de anti-oxidantes, como anti-SOD1

Glioblastomas are grade 4 astrocytomas, presenting a medium overall survival of 15 months with standard treatment which consists in tumor resection, radiotherapy and chemotherapy with temozolomide (TMZ). Previously, our group showed upregulation of plasmatic membrane Toll-like receptors (TLRs) in human astrocytoma samples, particularly in GBM of mesenchymal (MES) subtype, presenting the poorest outcome. TLR4 is an important immune receptor, responsible to recognize molecules associated to pathogens and cellular damage. TLR4 stimulation may activate different pathways leading either to cell survival or cell death. The general aim of the present study was to analyze TLR4 signaling pathways in GBM cells and explore possible druggable targets. First, we confirmed TLR4 presence in human astrocytoma samples, and GBM cell lines of MES subtype, U87MG and A172. The lipopolysaccharide (LPS) treatment, TLR4 classical activator, led to late nuclear translocation of NF-B, one of the main transcription factor downstream of TLR4 activation, with upregulation of IL1B and gene related to DNA repair. Genes associated to non-canonical TLR4 pathway, as ripoptosome and inflammasome, were also upregulated, which were validated in silico analysis of the public The Cancer Genome Atlas (TCGA) GBM RNASeq database. The combined LPS+TMZ treatment increased apoptotic rate of U87MG cells, however, a further increment was observed with the addition of the DNA repair inhibitor, anti-RAD51 / Amuvatinib,compared to each treatment alone. Next, the effect of the combined therapy with LPS and metformin (MET) was analyzed in U87MG and A172 by RNASeq. MET is a known medication for diabetes and inhibits complex I of oxidative phosphorylation, and also may cause an anti-inflammatory response, including NF-B activation. MET led to a decrease of tumor cell viability and mitochondrial stress in both lineages. In U87MG, LPS+MET upregulated pro-apoptotic gene expressions and downregulated pro-survival gene expressions and the combined treatment LPS+MET+TMZ increased significantly the apoptosis of tumor cells. In contrast, in A172, with upregulation of anti-oxidative genes, the apoptotic rate of the combined treatment was similar to TMZ alone. However, MET treatment decreased the expression of genes related to chromosome segregation, which was compatible to observed cell cycle arrest after MET+TMZ treatment. Upregulation of anti-oxidative genes, mainly SOD1, was validated in silico in the TCGA dataset in the mitochondrial (MTC) GBM subtype, with similar expression profile detected in A172. TLR4 activation was confirmed in the glycolytic/plurimetabolic (GPM) GBM subtype, compatible with the expression profile observed in U87MG. Therefore, the results of the present study suggested that GBM-GPM are eligible for MET treatment and an association with DNA repair inhibitors may increment tumoral cell death, while GBM-MTC may benefit from combined treatment with anti-oxidative inhibitors as anti-SOD1