Intrinsically disordered proteins (IDPs) are implicated in the regulation of many important processes within the cell, a factor that explains their abundance in the proteome. Often, IDPs undergo local or global conformational rearrangements coupled to binding. However, the mechanisms by which IDPs interact with their partners have been a topic of debate and remain poorly understood. Here, we characterized the dynamics of the VirB9 C-terminal domain (VirB9^Ct), and its binding mechanism to the N-terminal tail of VirB7 (VirB7^Nt). The interaction between the two domains is essential for the assembly of a supramolecular complex, the Type IV Secretion System from the phytopathogen Xanthomonas citri, which is responsible for the secretion of toxins that lead to bacterial killing. VirB7^Nt is completely disordered in the unbound state, while VirB9^Ct has characteristics of a molten globule. The unbound state of VirB9^Ct was characterized by a combination of Circular Dichroism spectroscopy, Isothermal Titration Calorimetry, Differential Scanning Calorimetry, Chemical Exchange Saturation Transfer (CEST) NMR experiments, and ANS fluorescence assays. We found that, in the unbound state, VirB9^Ct has similar secondary and tertiary structures as when bound to VirB7^Nt. Furthermore, in the unbound state VirB9^Ct samples the bound-conformation even in the absence of VirB7Nt, which points to conformational selection as recognition pathway. The interaction mechanism between VirB9^Ct and VirB7^Nt was elucidated by quantitative analysis of CEST and fluorescence stopped flow experiments. The results support the view that their interaction occurs through conformational selection at 25°C, but becomes more complex at higher temperatures due to the intrinsic dynamics of VirB9^Ct, and, in this case a combined CS-IF mechanism predominates. Overall, these results highlight the need of combining different biophysical methods to elucidate protein-protein interaction mechanisms, and contribute to the understanding of molecular recognition pathways and their complexity.

Proteínas intrinsicamente desordenadas, ou do inglês, IDPs, estão envolvidas na regulação de uma varieade de processos celulares, o que explica a sua abundância no proteoma. Frequentemente, IDPs sofrem rearranjos conformacionais locais ou globais, acoplados à ligação a outras moléculas. Os mecanismos pelos quais IDPs interagem com seus parceiros moleculares têm sido alvo de debates, e permanecem pouco compreendidos. Neste trabalho, nós caracterizamos a dinâmica conformacional do domínio C-terminal de VirB9 (VirB9^Ct), e o mecanismo de interação de VirB9^Ct com a cauda N-terminal de VirB7 (VirB7^Nt). A interação entre os dois domínios é essencial para a montagem de um complexo supramolecular, o Sistema de Secreção do Tipo IV do fitopatógeno Xanthomonas citri, o qual é responsável pela secreção de toxinas que levam à morte baceriana. VirB7^Nt é completamente desordenada na forma não ligada, enquanto que VirB9^Ct possui caracter´sticas de molten globule. VirB9^Ct, no estado não ligado, foi caracterizada por uma combinação de espectroscopia de Dicroísmo Circular, Calorimetria Isotérmica de Titulação, Calorimetria Diferencial de Varredura, experimentos de RMN de transferência de saturação (CEST), e medidas de fluorescência de ANS. Encontramos que VirB9^Ct no estado não ligado apresenta estruturas secundária e terciárias semelhantes à forma ligada. Além disso, observamos que VirB9^Ct visita a conformação ligada mesmo na ausência de VirB7^Nt, o que indica que o mecanismo de reconhecimento entre as duas proteínas ocorre por seleção de conformações. O mecanismo de reconhecimento entre VirB9^Ct e VirB7^Nt também foi estudado quantitativamente por CEST e medidas de fluorescência em stopped-flow. Os resultados obtidos suportam a visao de que a interação entre VirB9^Ct e VirB7^Nt ocorre através de seleção de conformações a 25C, mas torna-se mais complexa em maiores temperaturas devido à dinâmica intrínseca de VirB9^Ct. Neste caso um mecanismmo combinado CS-IF é predominante. De forma geral, estes resultados ressaltam a necessidade da combinação de diferentes métodos biofísicos para elucidar mecanismos de interação proteína-proteína, e contribuem para a compreensão dos mecanismos de reconhecimento molecular e sua complexidade.