As tecnologias de Sequenciamento de Nova Geração (SNG) mostraram um crescimento acelerado nos últimos anos. Uma das principais aplicações do SNG é a metagenômica, que identifica patógenos emergentes para os quais não há diagnóstico estabelecido. Uma técnica promissora e de custo relativamente baixo é a tecnologia portátil MinION. Um dos maiores problemas da plataforma MinION é a falta de protocolos otimizados (pré-preparo da amostra, concentração viral, extração e amplificação). Portanto, o objetivo desse trabalho é padronizar e otimizar os procedimentos de metagenômica viral aplicados ao sequenciamento de nanoporos. O controle do sequenciamento foi realizado utilizando vírus RNA (bolsa de sangue positiva para HIV, cycle threshold - Ct=25,8) e vírus DNA (citomegalovírus humano cultivado). Estes controles foram utilizados para padronizar os processos de concentração viral, extração e preparo de bibliotecas metagenômicas. Inicialmente, após a degradação enzimática do material do hospedeiro, foi realizada a concentração viral por ultracentrifugação, que foi consequentemente confirmada com microscopia eletrônica de transmissão. Além disso, foi realizada a concentração viral por método químico utilizando poliacrilamida linear. As amostras concentradas foram extraídas com dois kits diferentes a fim de comparação: QIAamp UltraSens Virus (QIAGEN) e High Pure Viral Nucleic Acid Large Volume (Roche Life Science). Em seguida, comparamos diferentes métodos de fragmentação do DNA: fragmentação mecânica (Covaris), fragmentação química (endonucleases), amplificação pelo sistema de primer SMART-9N e amplificação isotérmica sem ligação dos fragmentos. Todas as amostras foram sequenciadas utilizando a flow cell 9.4.1 no dispositivo MinION. Na microscopia eletrônica de transmissão visualizamos várias partículas de HIV (tamanho esperado 80-100 nm) bem como uma abundância de fagos, que mostrou a importância da concentração viral. Em seguida, a análise bioinformática revelou que as amostras concentradas por LPA, extraídas pelo kit QIAamp UltraSens Virus e amplificadas pelo método SMART-9N apresentaram maior abundancia viral e número elevado de leituras dos vírus tidos como controles (HIV e CMV). Portanto, propusemos que a metagenômica por sequenciamento de nanoporos seja feita utilizando esses métodos e concluímos que a padronização de todos os procedimentos de pré-processamento de amostras é crucial para melhores resultados de sequenciamento utilizando a tecnologia MinION, que permitirá sua aplicação na área de metagenômica viral e na descoberta de patógenos virais desconhecidos ou reemergentes.

Next Generation Sequencing (NGS) technologies have shown accelerated growth in the recent years. One of the main applications NGS is metagenomics, which identifies emerging pathogens without established diagnosis. A promising and relatively low-cost technique is the portable MinION technology. One of the main problems of the MinION platform is the lack of optimized protocols (sample pre-preparation, viral concentration, extraction and amplification). Therefore, the objective of this work is to optimize viral metagenomics procedures applied to nanopore sequencing. We used two types of controls: for RNA viruses a blood unit of plasma obtained from HIV-positive blood donor with cycle threshold of Ct=25.8 and for DNA viruses: cultivated human cytomegalovirus (HCMV). These controls were used as a positive control to optimize the processes of viral concentration, extraction and preparation of metagenomic libraries. Initially, after enzymatic host nucleic acids degradation, viral concentration was performed by ultracentrifugation, which was subsequently confirmed with transmission electron microscopy. In addition, viruses were also concentrated by chemical method using linear polyacrylamide (LPA). Concentrated samples were extracted by two different strategies that were compared: QIAamp UltraSens Virus (QIAGEN) and High Pure Viral Nucleic Acid Large Volume (Roche Life Science). Subsequently, we compared different DNA fragmentation methods: mechanical fragmentation (Covaris), chemical fragmentation (endonucleases), amplification by the SMART-9N primer system and isothermal amplification without ligation. All samples were sequenced using flow cell 9.4.1 on the MinION device. The transmission electron microscopy showed the presence of HIV particles (expected size 80-100 nm) and abundance of phages, revealing its adequacy for viral concentration. The bioinformatic analysis revealed that the samples concentrated by LPA, extracted by the QIAamp UltraSens Virus kit and amplified by the SMART-9N method, showed higher viral abundance and a high number of HIV and HCMV reads. Therefore, we propose that nanopore sequencing metagenomics might be performed including the aforementioned steps and we conclude that the optimization of all sample pre-processing procedures is crucial for better sequencing results using MinION technology, allowing its application in the area of viral metagenomics and in the discovery of emerging or reemerging viral pathogens.