O ferro é um micronutriente essencial, necessário como cofator em diversas reações biológicas, mas seu excesso intracelular pode gerar danos. Em bactérias, a homeostase de ferro envolve sistemas regulatórios que controlam a captação, em limitação, e o efluxo e estocagem, em excesso, deste metal. Neste trabalho, identificamos e caracterizamos novos sistemas regulatórios e de resistência ao ferro em Chromobacterium violaceum, uma bactéria ambiental que ocasionalmente causa graves infecções em humanos. A identificação não enviesada de novos fatores de transcrição e sistemas de detoxificação de ferro foi realizada pela varredura de uma biblioteca de 10 mil mutantes de transposon. A varredura em placas PSA-CAS revelou 25 genes com inserção do transposon com alteração dos halos de sideróforos. Os genes mutados agrupam em diferentes categorias funcionais, sendo que seis deles foram estudados por codificar sistemas regulatórios. Mutação nula dos genes csrA (CV_2600) e CV_0635 não tiveram o mesmo fenótipo encontrado na varredura. Já inserções e mutação nula no sistema de dois componentes AirSR (CV_0536 e CV_0537) levaram ao aumento dos halos de sideróforo. A inserção e a mutação nula do regulador VitR levaram ao aumento dos halos de sideróforo e diminuição na produção de biofilme, violaceína e proteases. Determinamos que esses efeitos ocorreram exclusivamente devido à desrepressão de vioS no mutante vitR. VioS é um inibidor do regulador CviR do sistema de quorum sensing (QS) CviIR. De fato, inserção em cviR e mutação nula de cviI e cviR levaram ao aumento de halos de sideróforo. Ensaios de RNA-seq dos mutantes ΔcviI e ΔcviR revelaram que CviR regula conjuntos de genes dependentes e independentes de CviI. Processos clássicos dependentes de QS (violaceína, proteases e antibióticos) foram ativados em alta densidade celular por CviI e CviR. No entanto, genes relacionados à homeostase do ferro e outros processos foram regulados por CviR, mas não por CviI, sugerindo que CviR atua sem seu autoindutor canônico CviI. Nossos dados revelaram uma complexa cascata regulatória envolvendo o regulador VitR atuando upstream do sistema de QS para controlar a homeostase do ferro mediada por sideróforos em C. violaceum. A varredura da biblioteca de transposon em excesso de ferro revelou mutantes susceptíveis ao excesso de ferro com inserção do transposon em dezoito genes, sendo que dois sistemas regulatórios foram selecionados para caracterização. O primeiro sistema consiste do operon CV_3659-58-57 que codifica o fator de transcrição da família MarR CV_3659 e a citocromo bd oxidase CV_3658-57. Demonstramos que o regulador CV_3659 reprime a expressão de seu operon e que a citocromo bd oxidase é necessária para a resistência de C. violaceum a diferentes metais (zinco e ferro), ao sulfeto e ao estresse oxidativo e nitrosativo. Por fim, caracterizamos duas proteínas H-NS de C. violaceum. RNAseq revelou que as H-NS CV_1363 e CV_1243 silenciam a expressão de diversos genes em C. violaceum, com destaque para genes presentes em ilhas de patogenicidade. Como CV_1363 silencia a expressão de CV_1243, os efeitos de CV_1243 em fenótipos e regulação gênica só foram evidenciados com mutação de ambas H-NS. Caracterização fenotípica revelou que as H-NS de C. violaceum estão envolvidas na produção de violaceína, motilidade do tipo swimming, na homeostase de ferro e na resistência ao pH ácido e a alta osmolaridade. Em conclusão, C. violaceum utiliza diversos sistemas regulatórios para controlar a homeostase de ferro, tanto a captação mediada por sideróforos quanto a tolerância ao excesso de ferro.

Iron is an essential micronutrient, necessary as a cofactor in several biological reactions, but its intracellular excess can cause damage. In bacteria, iron homeostasis involves regulatory systems that control the uptake, in limitation, and the efflux and storage, in excess, of this metal. In this work, we identified and characterized new regulatory and iron resistance systems in Chromobacterium violaceum, an environmental bacterium that occasionally causes severe infections in humans. Unbiased identification of novel transcription factors and iron detoxification systems was performed by screening a library of 10,000 transposon mutants. The screen on PSA-CAS plates revealed 25 genes with transposon insertion with altered siderophore halos. The mutated genes grouped into different functional categories, and six of them were studied for encoding regulatory systems. Null mutation of csrA (CV_2600) and CV_0635 did not have the same phenotype found in the screen. Insertions and null mutation in the AirSR two-component system (CV_0536 and CV_0537) led to increased siderophore halos. The insertion and null mutation of the VitR regulator led to an increase in siderophore halos, and a decrease in the production of biofilm, violacein, and proteases. We determined that these effects occurred exclusively due to derepression of vioS in the vitR mutant. VioS is an inhibitor of the CviR regulator of the quorum sensing (QS) system CviIR. Indeed, insertion into cviR and null mutation of cviI and cviR led to an increase in siderophore halos. RNA-seq of the ΔcviI and ΔcviR mutants revealed that CviR regulates a set of CviI-dependent and independent genes. Classical QS-dependent processes (violacein, proteases, and antibiotics) were activated at high cell density by CviI and CviR. However, genes related to iron homeostasis and other processes were regulated by CviR but not by CviI, suggesting that CviR acts without its canonical CviI autoinducer. Our data revealed a complex regulatory cascade involving the VitR regulator acting upstream of the QS system to control siderophore-mediated iron homeostasis in C. violaceum. Screen of the transposon library in iron excess revealed iron-susceptible mutants with transposon insertion in eighteen genes, and two regulatory systems were selected for further characterization. The first system consists of the CV_3659-58-57 operon that encodes the MarR family transcription factor CV_3659 and the cytochrome bd oxidase CV_3658-57. We demonstrated that the regulator CV_3659 represses the expression of its own operon and that the cytochrome bd oxidase is necessary for the resistance of C. violaceum to different metals (zinc and iron), to sulfide and to oxidative and nitrosative stresses. Finally, we characterized two C. violaceum H-NS proteins. RNAseq revealed that the H-NS CV_1363 and CV_1243 silence the expression of several genes in C. violaceum, such as those found in pathogenicity islands. As CV_1363 silences the expression of CV_1243, the effects of CV_1243 on phenotypes and gene regulation were only evidenced with mutation of both H-NS. Phenotypic characterization revealed that the C. violaceum H-NS are involved in violacein production, swimming motility, iron homeostasis, and resistance to acidic pH and high osmolarity. In conclusion, C. violaceum uses several regulatory systems to control iron homeostasis, both siderophore-mediated iron uptake and tolerance to excess of iron.