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Tese de Doutorado
DOI
10.11606/T.9.2011.tde-12092012-140428
Documento
Autor
Nome completo
Joás Lucas da Silva
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Paulo, 2011
Orientador
Banca examinadora
Hirata, Mario Hiroyuki (Presidente)
Almeida, Elisabete Aparecida de
Cardoso, Rosilene Fressatti
Leão, Sylvia Luisa Pincherle Cardoso
Sampaio, Jorge Luiz Mello
Título em português
Desenvolvimento de micobacteriófago recombinante para detecção rápida de bacilos da tuberculose
Palavras-chave em português
Micobacteriófagos
Recombinação
Tuberculose
Resumo em português
O diagnóstico da tuberculose por métodos tradicionais é lento e laborioso. Por outro lado, os testes moleculares são rápidos, mas com custo elevado para países em desenvolvimento. Este projeto teve o objetivo de inserir no micobacteriófago D29 o gene que codifica a proteína verde fluorescente (eGFP) e estudar o fago recombinante na detecção rápida de bacilos da tuberculose. Para tanto, foi inserido o cassete Hsp60- eGFP no genoma do fago D29 por recombinação. Micobacteriófagos recombinantes purificados foram utilizados para infectar M. smegmatis mc2 155 e M. tuberculosis H37Rv durante um período de 1- 6h nas temperaturas de 30°C, 37°C e 42°C. Bactérias fluorescentes foram observadas em um período de 2h, mas em número reduzido, indicando que o micobacteriófago lisou às células rapidamente, dificultando a expressão da eGFP e visualização em microscópio de fluorescência. A deleção do gene LysA, foi efetuada a fim de aumentar o período de latência do fago. Não foi possível a purificação de fagos recombinantes, devido à baixa quantidade de recombinantes nos halos de inibição. Será necessário a redução da atividade o gene LysA e, provavelmente, de outros genes associados a lise celular a fim de aumentar a concentração de eGFP no interior da célula.
Título em inglês
Development of recombinant micobacteriophage for rapid detection of tubercle bacillus
Palavras-chave em inglês
Mycobacteriophages
Recombineering
Tuberculosis
Resumo em inglês
Classical biochemical methods for Mycobacterium tuberculosis identification are lengthy and time-consuming. On the other hand, molecular assays are rapid but expensive for developing countries. This project aimed to insert into the mycobacteriophage D29, the gene coding for the green fluorescent protein (eGFP) and use the recombineered phage to detect Mycobacterium tuberculosis rapidly and less costly. For that, the Hsp-eGFP cassette was inserted into D29 genome. Recombineered mycobacteriophages was purified and used to infect M. smegmatis mc2 155 and M. tuberculosis H37Rv from 1-6 hs at 30°C, 37°C and 42°C. Observation of fluorescent bacteria was difficult and only a small number of them were seen at 2 hs of infection. This indicated that recombineered bacteriophages were lysing cells rapidly. Deletion of LysA gene, was carried out to increase the time needed for bacterial lysing. it was not possible to purify mutant mycobacteriophages due to the low concentration of recombinant phages. We conclude that might be necessary the deletion of other genes such as LysB, a gene also involved in cell lysis and reduction LysA activity to increase the concentration of eGFP inside cells.
 
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Data de Publicação
2012-10-22
 
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