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Tese de Doutorado
DOI
10.11606/T.87.2018.tde-18092018-170642
Documento
Autor
Nome completo
Ana Raquel de Souza Monteiro
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Paulo, 2011
Orientador
Banca examinadora
Vicente, Elisabete Jose (Presidente)
Azevedo, João Lucio de
Lima, José Augusto Ferraz de
Paula, Claudete Rodrigues
Rodriguez, Monica Bucciarelli
Título em português
Expressão de hormônio de crescimentro da carpa Hypophthalmichthys molitrix em leveduras.
Palavras-chave em português
Pichia pastoris
Saccharomyces cerevisiae
Produção de alimento
Proteína heteróloga
Pscicultura
Resumo em português
Neste trabalho, construiu-se linhagens recombinantes de Pichia pastoris e Saccharomyces cerevisiae que expressam hormônio de crescimento de carpa (GHc). Para expressão de GHc em P. pastoris, o cDNA de GH de H. molitrix foi inserido nos plasmídeos pHILD2 (expressão interna) e pPIC9K (expressão e secreção) dando origem aos plasmídeos pHILGH e pPICGH. A expressão em S. cerevisiae foi controlada pelo promotor e terminador PGK e o cassete de expressão ladeado por elementos δ, dirigindo a integração em múltiplas cópias no genoma. Ainda, construiu-se um plasmídeo onde a sequência de GHc foi fusionada a uma sequência sinal modificada (sequência sinal de proteína de K. lactis, fusionada a fragmento de interleucina humana), visando altos níveis de secreção. Os transformantes (expressão interna) expressaram proteína recombinante de 20 KDa. Um dos transformantes de S. cerevisiae secreta cerca de 1045,0 µg/ml de GHc. As proteínas recombinantes apresentaram hibridação específica contra anticorpo anti GHc comercial indicando que são biologicamente ativas.
Título em inglês
Expression in yeasts of the growth hormone of the carp Hypophthalmichthys molitrix.
Palavras-chave em inglês
Pichia pastoris
Saccharomyces cerevisiae
Feeding supplementation
Fishering
Heterologous protein
Resumo em inglês
In order to achieve the GHc expression in P. pastoris, the GH cDNA of the carp H. molitrix was introduced into the plasmids pHILD2 (intracellular expression) and pPIC9K (expression and secretion) originating the plasmids pHILGH and pPICGH. The expression of the GH cassette in S. cerevisiae was driven by the PGK promoter and terminator and the cassette was flanked by the δ elements, which provides multiple copies integration into the genome. We also constructed a plasmid in which the GHc cDNA sequence was fused to a modified signal sequence (K. lactis protein signal sequence fused to a human interleukin fragment), aiming to reach high levels of secretion. P. pastoris and S. cerevisiae recombinant clones (intracellular expression) were shown to express a recombinant protein of 20 KDa. One of the S. cerevisiae recombinant clones secreted around 1045.0 µg/ml of GHc. The recombinant proteins showed hybridization of the bands against antibody anti-commercial GHc. The results indicate that the recombinant proteins produced in this work are biologically active.
 
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Data de Publicação
2018-09-18
 
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