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Dissertação de Mestrado
DOI
10.11606/D.76.2018.tde-19102018-090529
Documento
Autor
Nome completo
Alfredo Jose Florez Ariza
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Carlos, 2018
Orientador
Banca examinadora
Portugal, Rodrigo Villares (Presidente)
Borges, Júlio César
Weber, Gerald
Título em inglês
Structural analysis of DNA wrapping in bacterial transcription initiation complex by transmission electron microscopy and single particle analysis
Palavras-chave em inglês
DNA wrapping
RNA polymerase
Single particle analysis
Transcription initiation Complex
Transmission electron Microscopy
Resumo em inglês
The transcription initiation is the first step in gene expression and an important regulation step in all living organisms. In bacteria, it has been proposed that DNA bending and its wrapping on the surface of E. coli RNAP might facilitate the opening of the transcription bubble, which is necessary for the initiation of gene transcription. In this work, it is shown the first structural study to evaluate a DNA wrapping model, including its length and the relative position in the bacterial transcription initiation complex (RP complex), assembled between RNA polymerase-σ70 holoenzyme (RNAP) and a λPR promoter (-100 to +30 wild type). RP complex was prepared and negatively stained with 2% uranyl acetate on a thin-carbon coated grid and the data acquisition of 500 images was performed in a JEM-2100 (JEOL, Japan) microscope equipped with an F-416 CMOS camera (TVIPS, Germany). Single particle analysis of 16,015 particles, grouped in 666 class-averages, was conducted using IMAGIC 4D software (Image Science, Germany) to obtain a three-dimensional model of the RP complex at 20Å resolution. After the rigid-body fitting of the RNAP crystallographic structure (PDB 4YG2) and the modeled DNA promoter, it was observed that the regions 1.2 and 4.2 of the σ70 subunit interacts with the consensus zones, -10 and -35 hexamers of the promoter. Furthermore, it was possible to observe that αCTDs (C-terminal domain) in both alpha subunits would be oriented to facilitate the interaction with the first and second UP-elements regions, respectively (centered around –50 and -75 positions in the promoter). These was enabled by the presence of the characteristics motifs helix-hairpin-helix in these domains. In addition, the downstream DNA, from the transcription bubble, appears to be inside the protein main channel, oriented in a way to enable interactions with the RNAP clamp and jaws. Finally, it was observed that the DNA wrapping has ~32 nm of total length and involves a promoter bent of ~255° around the RNAP surface. The 3D-model obtained in this study is the very first direct structural confirmation of the DNA promoter wrapping in a bacterial transcription initiation complex.
Título em português
Análise estrutural do enovelamento do DNA no complexo da iniciação de transcrição bacteriano usando microscopia eletrônica de transmissão e análise de partículas isoladas
Palavras-chave em português
Análise de partículas isoladas
Complexo da iniciação da transcrição
Enovelamento do DNA
Microscopia eletrônica de transmissão
RNA polimerase
Resumo em português
A iniciação da transcrição é o primeiro passo na expressão gênica e importante ponto de regulação em todos os organismos vivos. Em bactérias, foi proposto que o enovelamento do DNA na superfície da RNAP de E. coli pode facilitar a abertura da bolha de transcrição, necessária para o início da transcrição gênica. Neste trabalho, é apresentado o primeiro estudo estrutural direto para avaliar o comprimento do enovelamento do DNA e sua posição no complexo de iniciação da transcrição bacteriana (complexo RP), montado entre a holoenzima RNA polimerase-σ70 (RNAP) e um promotor λPR (-100 para +30, tipo selvagem). Amostras do complexo RP foram preparadas e contrastadas negativamente com 2% de acetato de uranila em uma grade com filme fino de carbono e a aquisição de 500 imagens foi realizada em um microscópio JEM-2100 (Jeol, Japão) equipado com uma câmera CMOS F-416 (TVIPS, Alemanha). A análise de partículas isoladas de 16.015 partículas, agrupadas em 666 médias de classe, foi conduzida usando o software IMAGIC 4D (Image Science, Alemanha) para obter um modelo tridimensional do complexo RP, a 20Å de resolução, estimado pelo critério de ½ bit. Após o ajuste de corpo rígido da estrutura cristalográfica da RNAP (PDB 4YG2) e do promotor de DNA modelado, observou-se que as regiões 1.2 e 4.2 da subunidade σ70 interagem com as zonas de consenso, hexâmeros -10 e -35, do promotor. Além disso, foi possível observar que os αCTDs (domínio C-terminal) em ambas as subunidades alfa estariam orientados para facilitar uma possível interação com a primeira e segundas regiões dos elementos UP, respectivamente (centradas em torno das posições –50 e -75 do promotor). Estas seriam possíveis devido à presença de alguns motivos de características hélice-grampo-hélice nesses domínios. Além disso, a região do promotor, downstream da bolha de transcrição, parece estar dentro do canal principal da proteína, orientado de forma a possibilitar interações com o clamp e jaw da RNAP. Finalmente, foi observado que o comprimento total do enovelamento de DNA envolve cerca de 32 nm e 255° de rotação do DNA ao redor da superfície da RNAP. Portanto, este modelo 3D é a primeira confirmação estrutural direta do enovelamento de DNA em um complexo bacteriano de iniciação da transcrição.
 
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Data de Liberação
2020-10-18
Data de Publicação
2018-10-24
 
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