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Dissertação de Mestrado
Documento
Autor
Nome completo
Telma Regina Ramos Silva Poloni
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
Ribeirão Preto, 2009
Orientador
Banca examinadora
Quintana, Victor Hugo Aquino (Presidente)
Bronzoni, Roberta Vieira de Morais
Yamamoto, Aparecida Yulie
Título em português
Detecção e tipificação do vírus da dengue por RT-PCR em tempo real
Palavras-chave em português
dengue
diagnóstico
RT-PCR em tempo real
sorotipo específico
Resumo em português
A dengue é uma doença infecciosa de transmitida pela picada de mosquitos do gênero Aedes. O vírus da dengue (DENV), pertencente ao gênero Flavivirus, família Flaviviridae, é atualmente um importante problema de saúde pública em todo o mundo. São reconhecidos quatro sorotipos antigenicamente distintos (DENV-1, -2, -3 e -4). A doença causada por qualquer um dos sorotipos cursa de forma assintomática ou com quadro clínico que varia desde uma febre indiferenciada e autolimitada, passando pela febre clássica da dengue (FD) até quadros graves de febre hemorrágica da dengue (DHF). O diagnóstico clínico é difícil de ser realizado principalmente na fase aguda da doença em que os sintomas são muito similares aos de outras infecções febris agudas, ficando a cargo do laboratório o diagnóstico definitivo. Os métodos sorológicos para detecção de anticorpos IgM/IgG são os mais amplamente utilizados, mas inadequados para diagnóstico precoce uma vez que detectam anticorpos a partir do sexto dia do início dos sintomas. Os métodos moleculares estão sendo cada vez mais utilizados para o diagnóstico precoce por serem mais rápidos e sensíveis que a sorologia e o isolamento viral. Neste estudo comparamos a sensibilidade de uma RT-PCR em tempo real gênero específica com um ELISA para detecção da proteína NS1 comercialmente disponível analisando amostras de soro de pacientes com dengue. Também foram desenvolvidos dois protocolos de RT-PCR em tempo real para identificação do sorotipo viral, uma contendo primers para extremidade 5 do genoma viral e outra contendo primers para a região codificadora da proteína NS5. A RT-PCR em tempo real gênero específica mostrou-se mais sensível que o ELISA, principalmente nas amostras que apresentavam baixa carga viral. A RT-PCR em tempo real contendo os primers para a extremidade 5 apresentou uma sensibilidade baixa quando comparada com a RT-PCR genérica, porém foi mais sensível que aquela contendo os primers para a região codificadora da proteína NS5. Considerando os resultados obtidos, sugerimos uma estratégia de triagem dos casos suspeitos de dengue utilizando a RT-PCR genérica para posteriormente identificar o sorotipo viral com o protocolo que utiliza os primers da extremidade 5. Embora este último protocolo tenha sido pouco sensível, a identificação do sorotipo infectante em algumas amostras é suficiente para definir qual o sorotipo circulante durante uma epidemia.
Título em inglês
Detection and typing of dengue virus by real time RT-PCR assays
Palavras-chave em inglês
dengue
diagnosis
real time RT-PCR
specific serotype
Resumo em inglês
Dengue is an infectious disease transmitted by the biting of mosquitoes of Aedes genus. Dengue virus (DENV), belonging to the Flavivirus genus, Flaviviridae family, is an important public health problem worldwide. Four antigenically distinct viruses are recognized (DENV-1, -2, -3, e -4). Infection with any of the virus serotypes causes a spectrum of the illness ranging from inapparent or mid viral syndrome to classic dengue fever (DF) and severe hemorrhagic disease (DHF). The clinical diagnosis is difficult especially in the acute phase of the disease when the symptoms are very similar to other febrile illness, corresponding to the laboratory the definitive diagnosis. Serological methods detecting antibodies IgM/IgG are the more widely used; however, they are inappropriate for early diagnosis since these methods detect antibodies after six day of the onset of symptoms. The molecular methods are more frequently used for the early diagnosis because they are faster and more sensitive than serological methods and virus isolation. In this study, we have compared the sensitivity of a generic real time RT-PCR with a commercial ELISA for the NS1 protein analyzing serum samples from patients with dengue virus infection. We have also developed two protocols of real time RT-PCR to identify dengue serotype, one of them containing primers to the 5 end and the other, primers to the NS5 coding region. The generic real time RT-PCR showed to be more sensitive than the ELISA, principally, between the samples with low viral load. The real time RT-PCR containing primers to the 5 end showed a lower sensitivity than the generic real time RT-PCR; however, it was more sensitive than that containing primers to the NS5 coding region. Considering these results, we suggest the use of the generic real time RT-PCR to screen the dengue suspected cases and then to identify the serotype using the protocol that include the primers to the 5 end. Although the last protocol has shown a low sensitive, the identification of the infecting serotype in some of the samples is enough to define which serotype is circulating during the epidemic period.
 
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Telma.pdf (2.30 Mbytes)
Data de Publicação
2009-09-30
 
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