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Dissertação de Mestrado
DOI
10.11606/D.59.2008.tde-09042008-171700
Documento
Autor
Nome completo
Alexandre Favarin Somera
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
Ribeirão Preto, 2008
Orientador
Banca examinadora
Jorge, Joao Atilio (Presidente)
Ernandes, José Roberto
Rosa, Jose Cesar
Título em português
Estudo da multiplicidade de formas de ß-glicosidases de Aspergillus versicolor
Palavras-chave em português
Aspergillus versicolor
Endo-H
glicosilação
PNGase-F
ß-glicosidases
Resumo em português
Este trabalho procurou avaliar algumas isozimas envolvidas com o processo de degradação de polissacarídeos da parede celular vegetal, encontradas em Aspergillus versicolor, fungo pertencente a um gênero onde a multiplicidade de componentes enzimáticos com a mesma atividade oscila de uma a três. Duas ß-xilosidases foram purificadas por meio de DEAE-celulose e precipitação com sulfato de amônia. Ambas mostraram-se enzimas que, quando deglicosiladas por PNGaseF, apresentam mesmos mapas trípticos. A glicosilação mostrou-se importante para a manifestação de diferenças bioquímicas relacionadas às interações com ambiente eletrolítico adjacente, visto as mudanças das curvas de pH e alterações de comportamento frente a sais de íons metálicos, tão bem como para a manutenção do funcionamento das enzimas. Também foi verificado que as diferentes formas glicosiladas periplásmicas são produzidas em meios distintos (xilana e xilose), cujos pH finais corresponderam aos pH das enzimas encontradas. Por meio de zimogramas, verificou-se que estas não eram produzidas de imediato, mas selecionadas ao longo do tempo de cultivo. Esta seleção foi inicialmente independente do pH, visto este, mesmo tamponado, ser corrigido pelo fungo, de modo a se apresentar, ao final de 48h, correlato com o da enzima selecionada. Exame cromatográfico em Concanavalina-A das enzimas deglicosiladas por EndoH mostraram que a oriunda de xilana tem aporte maior de ramificações biantenárias, que são ricas em galactose. Ambas apresentaram mapas trípticos iguais. A ß-xilosidase induzida por xilana apresentou proporções de manose, galactose e glucose iguais a 69,68 : 30,25 : 0,056 %, respectivamente, enquanto que ß-xilosidase induzida por xilose apresentou proporções iguais a 85,35 : 14,54 : 0,094%, respectivamente, resultado que corrobora com a resultado anterior. Duas ß-glucosidases de superfície micelial foram purificadas por meio de DEAE-Sephacel e DEAE-celulose. Ambas mostraram-se mais semelhantes entre si que as ß-xilosidases, e independentes de fonte de carbono ou pH. No entanto, apresentaram diferenças frente à inibição por celobiose (acentuada a partir de 10mM para ß-glucosidase I e 20mM para B-glucosidase II) e, embora sutis, a pH. Após serem submetidas a 45 ºC por 30min (temperatura que induziu segunda conformação estável) mostraram curvas de pH muito distintas, que foram eliminadas nas enzimas submetidas ao mesmo experimento após deglicosilação por PNGaseF. Ambas apresentaram mapas trípticos iguais. A ß-glucosidase I mostrou-se constituída de Man:Gal:Glu em proporções iguais a 78,36%:21,61%:0,033% do carboidrato total, respectivamente, e a ß-glucosidase II, Man:Gal:Glu iguais a 83,59%:16,38%:0,028%, respectivamente. Ambas também apresentaram sinergismo quando juntas. Sobre celobiose, foi verificado apenas em pH acima de 5.5. Sobre celooligossacarídeos, manifestou-se em pH 5,25. A ß-glucosidase I foi menos ativa que a ß-glucosidase II quando em ausência de glucose e celobiose na solução de reação inicial, situação na qual o contrário foi verdadeiro. O sinergismo foi drasticamente eliminado após deglicosilação por PNGaseF. Não se sabe se este resultado foi oriundo de mudanças cinéticas provocadas pela deglicosilação ou de uma possível eliminação de agregação anteriormente existente entre glicosiladas. O componente ß-glicosidásico extracelular foi purificado por meio de DEAE-Sephacel e Octyl-Sepharose, e se revelou um heteroagregado de fosfatase ácida com ß-glicosidase, que se mostrou estável e ativo em ampla gama de temperaturas e pH, com ótimos de 55ºC e 5,5, respectivamente. Entretanto, os perfis das curvas foram distintos entre as enzimas componentes. Somente concentrações superiores a 0,8mM de cloreto de cobalto apresentaram efeito desagregador, podendo ser empregado em conjunto com DEAE-celulose para purificação das enzimas isoladas. Quando separadas, fosfatase mostrou-se 260% mais ativa e ß-glicosidase, 50% menos ativa. Nesta condição, as faixas de pH se restringiram, acidificando-se, localizando-se entre pH 4,0 e 5,5. Aparentemente, a agregação reforça a atividade celobiásica. Fosfatase foi ativa sobre farelo de trigo e fitato de sódio e adsorveu fortemente em farelo de trigo. ß-glicosidase apresentou atividade sobre farelo de trigo, xilana e Avicel (liberando apenas glicose desta última), revelando-se enzima com atividade celobioidrolásica inespecífica, embora ávida por celobiose. As atividades foram determinadas como oriundas do mesmo sítio catalítico. ß-glicosidase não foi seqüestrada por farelo de trigo quando desagregada, resultado invertido quando reagregada. O seqüestro por farelo de trigo, aparentemente, deveu-se a interações entre sítio catalítico da fosfatase e substrato.
Título em inglês
Study of ß-glycosidases from Aspergillus versicolor
Palavras-chave em inglês
Aspergillus versicolor
Endo-H
glycosylation
PNGase-F
ß-glycosidase
Resumo em inglês
This study explored enzyme multiplicity on hemicelllulose and cellulose degrading systems. It first demonstrates the differences of PNGaseF deglycosylation and EndoH deglycosylation on forms of two ß-glicosidase activities present on surface of mycelia from Aspergillus versicolor grown on several carbon sources. Aspergillus versicolor produces ß-xylosidases with different biochemical properties and different degree of glycosylation, when grown on xylan or xylose. Were investigated the biochemical properties of these ß-xylosidases after deglycosylation. The purified enzymes were deglycosylated with endo-H or PNGase F. After this treatment both enzymes migrated faster in PAGE exhibiting the same Rf. On SDS-PAGE both enzymes showed similar migration. The optima temperature of xylan-induced and xylose-induced ß-xylosidases was 45 ºC and 40 ºC, respectively, and of 35 ºC after deglycosylation. The xylan-induced enzyme was more active at acidic pH than the xylose-induced enzyme. After deglycosylation the optimum pH of both enzymes was 6.0. The thermal resistance of the enzymes at 55 ºC showed a half-life of 15 min and 9 min for xylose-and xylan-induced enzymes, respectively. After deglycosylation both exhibited half-lives of 7.5. Native enzymes exhibited different response to ions, while deglycosylated enzymes exhibited identical sensitivity to ions. Limited proteolysis yielded coincident profiles in SDS-PAGE for both deglycosylated enzymes. All data suggest that the two A.versicolor ß-xylosidases share a common polypeptide core with differential glycosylation, apparently responsible for their biochemical and biophysical differences. Aspergillus versicolor also produced ß-glucosidases with different biochemical properties and different degree of glycosylation independently of carbon source. ß-Glucosidase I differed from ß-glucosidase II principally considering the amount and composition of carbohydrate, sensitivity to ions and pH. The purified enzymes shared the same tripitic maps and molecular masses after deglycosylations. All results showed that the biochemical differences observed for two enzymes were directly linked to PNGaseF- deglycosylation. Considering that Rfs, elution profiles on Con-A and residual glycosylation of both enzymes treated with EndoH or PNGaseF were the same, but differed on the mannose/galactose ratio, we inferred differences on proportion of hybrid-type/high-mannose-type glycans. The significance of this glycoform diversity was stressed in analysis of the action of mixture of both ß-glucosidases on celooligosoccharides and on cellobiose. This synergism was abolished after PNGaseF deglycosylation. These results are the first to show synergism between glycoforms of glycosil-hydrolases, representing a new class of synergistic type. The work also described a new form of aggregation between enzymes. Generally, ß-glycosidases are described as soluble components, attached to cell wall or free in the culture medium. This work verified that it could be extracelular adsorbed to wheat straw when aggregated with an acid phosphatase. The results strongly suggested that phosphatase is the component responsible for the process of adsorption on the substrate. The disaggregation was cobalt mediated, being not observed for another ions. The aggregation state has positive effects on glycosidase activity, extending pH ratio and increasing hydrolysis velocity. The opposite was found to phosphatase activity.
 
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Dissert.pdf (1.54 Mbytes)
Data de Publicação
2008-05-13
 
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