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Tese de Doutorado
DOI
10.11606/T.5.2018.tde-22102018-125609
Documento
Autor
Nome completo
Priscila Cristina Andrade
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Paulo, 2018
Orientador
Banca examinadora
Capelozzi, Vera Luiza (Presidente)
Atayde, Sandra Aparecida
Liberti, Edson Aparecido
Moreno, Fernando Salvador
Lopes, Fernanda Degobbi Tenorio Quirino dos Santos
Título em português
Estudo temporal dos colágenos (I, III, IV e V) e produtos de glicação avançada na sinóvia em modelo experimental de diabetes em ratos
Palavras-chave em português
Células endoteliais
Colágeno
Diabetes mellitus experimental
Líquido sinovial
Membrana sinovial
Produtos finais de glicação avançada
Transtornos da articulação
Resumo em português
Introdução: Diabetes Mellitus é caracterizada por hiperglicemia crônica, e este aumento excessivo de glicose circulante pode gerar danos vasculares e microvasculares pela deposição de produtos de gliclação avançada (AGE), principalmente em estruturas com alta vascularização, como é o caso da sinóvia. Por todas estas razões, o presente estudo estabeleceu, de maneira temporal, o processo de acomentimento sinovial, através do grau de remodelamento e as proteínas envolvidas neste processo, tido como o gatilho na lesão da articulação do joelho. Foram utilizados ratos wistar (n=60), divididos em três grupos, conforme tempo de indução ( 7, 30 e 60 dias), cada grupo era composto de 10 animais diabéticos, induzido por estreptozotocina (35mg/kg de peso) e 10 animais controle, recebendo infusão do mesmo volume de solução salina, após o tempo estipulado os animais foram sacrificados e a sinóvia coletada para as análises propostas. Análise morfológica através de colorações de hematoxilina-eosina para análise do perfil celular do tecido sinovial e Picrosírius para avaliação da histoarquitetura das fibras colágenas. A quantificação das fibras colágenas foi realizada pela coloração do Picrosírius em microscópio de luz polarizada e a caracterização e distribuição de seus tipos por imunofluorescência, para quantificação total da proteina de colágeno foi realizado a medição da 4-hidroxiprolina (HPO). Os produtos de glicação avançada foram analisados e quantificados por imufluorescência. A detecção e quantificação da imunoexpressão de marcadores bioquímicos como ET-1, TGF-B e IL17 foi realizado por método estereológico de contagem de pontos em reticulo, e como método de confirmação dos achados imunohistoquimicos foi realizado análise de expressão gênica dos Colágenos I,III, e V alfa- 1, alfa-2), por Reação de Transcrição Reversa com amplificação por PCR em Tempo Real (qRT-PCR). Resultados: Foi observado modificação da estrutura sinovial de forma temporal, acometendo inicialmente os vasos subsinoviais e tecidos adjacentes a ele, isso foi observado em tanto em análise morfológica como confirmado em quantificação por Picro em luz polarizada, as modificações se mostraram significantes nos grupos de 30 e 60 dias, quando comparado ao respectivo grupo controle, houve aumento do colágeno total, através do Picrosirius, como por dosagem de HOP. Os resultados foram confirmados por imunofluorescência com o aumento progressivo do COLI e diminuição de COLIII e COLV, o RAGE e AGE também tiveram sua expressão aumentada conforme a evolução no tempo de indução dos animais. Em análise da expressão de outras proteínas foi possível observar a detecção da ET-1 e da IL-17 nos animais diabéticos em comparação ao controle, houve também expressão significativa do TGF-B quando comparado ao respectivo controle. Na análise da expressão gênica foi possível observar aumento do COLV inicialmente, principalmente da cadeia alfa 2, do COLIII e COLI, confirmando achados histomorfométricos. Conclusão: O tecido sinovial demonstra remodelamento precoce ao redor dos vasos, essa mediação envolve o COL1 e os produtos de glicação avançada. Esta alteração no tecido sinovial pode ser responsável por desencadear o acometimento articular no diabetes mellitus
Título em inglês
Study of temporal collagens (I, III, IV and V) and advanced glycation end products synovium in experimental model of diabetes in rats
Palavras-chave em inglês
Advanced glycation end products
Articulation disorders
Collagen
Diabetes mellitus experimental
Endothelial cells
Synovial fluid
Synovial membrane
Resumo em inglês
Introduction: Diabetes Mellitus is characterized by chronic hyperglycemia, and this excessive increase of circulating glucose can cause vascular and microvascular damage by the deposition of advanced glycation products (AGE), especially in structures with high vascularization, as is the case of synovium. For all these reasons, the present study established, in a temporal way, the process of synovial concomitance, through the degree of remodeling and the proteins involved in this process, considered as the trigger in the lesion of the knee joint. Wistar rats (n = 60), divided into three groups, according to induction time (7, 30 and 60 days), each group consisted of 10 diabetic animals, induced by streptozotocin (35 mg / kg body weight) and 10 animals control, receiving infusion of the same volume of saline solution, after the stipulated time the animals were sacrificed and the synovium collected for the proposed analyzes. Morphological analysis using hematoxylineosin staining for analysis of the cellular profile of the synovial tissue and Picrosírius for evaluation of the histoarchitecture of the collagen fibers. The quantification of the collagen fibers was performed by the Picrosírius staining in a polarized light microscope and the characterization and distribution of its types by immunofluorescence, the measurement of 4-hydroxyproline (HPO) was performed for the total quantification of the collagen protein. Advanced glycation products were analyzed and quantified by impuluorescence. The detection and quantification of the immunoexpression of biochemical markers such as ET- 1, TGF-B and IL17 was performed by stereological method of reticule dot counting, and as a method of confirming the immunohistochemical findings, the analysis of the collagen I, III , and V alpha-1, alpha-2), by Reverse Transcription Reaction with Real-Time PCR Amplification (qRT-PCR). Results: Modification of the synovial structure was observed temporally, initially affecting subsynovial vessels and tissues adjacent to it, this was observed in both morphological analysis and confirmed in quantification by Picro in polarized light, the modifications were significant in the groups of 30 and 60 days, when compared to the respective control group, there was increase of the total collagen, through Picrosirius, as per HOP dosage. The results were confirmed by immunofluorescence with progressive increase of COLI and decrease of COLIII and COLV, RAGE and AGE also had their expression increased as the evolution in the induction time of the animals. In the analysis of the expression of other proteins it was possible to observe the detection of ET-1 and IL-17 in diabetic animals in comparison to the control, there was also significant expression of TGF-B when compared to the respective control. In the analysis of the gene expression it was possible to observe an increase of the COLV initially, mainly of the alpha 2 chain, of the COLIII and COLI, confirming histomorphometric findings. Conclusion: Synovial tissue demonstrates early remodeling around vessels, this mediation involves COL1 and advanced glycation products. This change in synovial tissue may be responsible for triggering joint involvement in diabetes mellitus
 
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Data de Publicação
2018-10-23
 
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