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Tese de Doutorado
DOI
Documento
Autor
Nome completo
Marcelo Andreetta Corral
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Paulo, 2018
Orientador
Banca examinadora
Gryschek, Ronaldo Cesar Borges (Presidente)
Costa, Silvia Figueiredo
Ekman, Luciana Regina Meireles Jaguaribe
Pinto, Pedro Luiz Silva
Título em português
Imunoproteômica aplicada ao aprimoramento do diagnóstico sorológico da estrongiloidíase humana
Palavras-chave em português
Antígenos de helmintos
Ensaio de imunoadsorção enzimática
Proteômica
Strongyloides stercoralis
Testes imunológicos
Western blotting
Resumo em português
Estrongiloidíase é a infecção parasitária causada pelo nematódeo Strongyloides stercoralis. Em indivíduos imunocompetentes cursa de forma crônica e assintomática na maioria dos casos; entretanto em imunocomprometidos pode assumir as formas graves como a hiperinfecção e/ou estrongiloidíase disseminada. Diante da baixa sensibilidade do diagnóstico parasitológico, vêm sendo realizadas pesquisas envolvendo o imunodiagnóstico, sobretudo voltadas para variações na obtenção das frações antigênicas heterólogas utilizando Strongyloides venezulensis como fonte de antígeno. O presente trabalho teve como objetivo aprimorar o diagnóstico sorológico da estrongiloidíase humana utilizando técnicas imunoproteômicas. Foram utilizadas amostras de fezes e soro de indivíduos imunocompetentes, divididos em três grupos de acordo com o resultado do exame parasitológico (P: positivos para S. stercoralis; OP: com outras parasitoses; N: negativos para quaisquer parasitos ou comensais) e imunocomprometidos divididos em dois grupos de acordo com o resultado do exame parasitológico (S+ID: positivos para S. stercoralis e S-ID: negativos para S. stercoralis ou qualquer parasito). As amostras de soro dos cinco grupos de pacientes foram submetidas a testes sorológicos a partir das frações antigênicas heterólogas de S. venezuelensis solúvel (TS) e de membrana (TM) utilizando as técnicas ELISA, DOT ELISA e Western-blotting. O ELISA apresentou 95% de sensibilidade em ambas frações antigênicas e 91,8% e 93,8% de especificidade para TS e TM, respectivamente. A técnica foi capaz de detectar anticorpos anti-Strongyloides em 34,4% e 28,1% em pacientes do grupo S+ID utilizando os antígenos TS e TM, respectivamente. O DOT ELISA foi executado somente com a fração TM e apresentou 95% de sensibilidade e 85,7% de especificidade detectando 28,1% de positividade no grupo S+ID. A banda de 40-35 KDa foi a única frequente em todos indivíduos do grupo P e a mais frequente em pacientes S+ID (62,5% para TS e 53,1% para TM). Géis réplicas foram realizados, excisados nas regiões de identificação proteica e submetidos a identificação de proteínas por espectrometria de massas. As proteínas mais abundantes nas frações antigênicas TS e TM foram actina e galectina. A fração TS foi purificada em coluna de afinidade para galectina, dada sua capacidade de modulação do sistema imunológico. As frações não ligada (NL) e galectina (Gal) foram utilizadas como antígenos na técnica ELISA apresentando 90% de sensibilidade e 89,8 e 75% de especificidade para NL e Gal, respectivamente. Foram positivos no ELISA 34,4% e 18,1% das amostras do grupo S+ID utilizando as frações NL e Gal, respectivamente. As técnicas sorológicas utilizando variações antigênicas constituem ferramentas alternativas importantes de diagnósticos que podem ser aplicadas à estrongiloidíase humana, sobretudo na população imunocomprometida
Título em inglês
Immunoproteomics applied to the improvement of serologic diagnosis of human strongyloidiasis
Palavras-chave em inglês
Antigens helminth
Enzyme-linked immunosorbent assay
Immunologic tests
Proteomics
Strongyloides stercoralis
Western blotting
Resumo em inglês
Strongyloidiasis is a parasitic infection caused by nematode Strongyloides stercoralis. In immunocompetent patients, it is chronic and asymptomatic in the most of cases. However, in immunocompromised patients, it can take on severe forms such as hyperinfection and / or disseminated strongyloidiasis. Due to the parasitological diagnosis's low sensitivity, research involving the immunoassay has been carried out, primarily focused on changes in the heterologous antigenic fractions using Strongyloides venezulensis as a source of antigen. The present work aimed to improve the serological diagnosis of human strongyloidiasis using immunoproteomic techniques. Feces and sera samples from immunocompetent patients were used and divided into three groups according to parasitological examination result (P: positive for S. stercoralis, OP: with other parasites, N: negative for any parasites or commensal). Samples from immunocompromised patients were divided into two groups according to the parasitological examination result (S+ID: positive for S. stercoralis and S-ID: negative for S. stercoralis or any parasite). Serum samples from the five groups of patients were submitted to serological tests by S. venezuelensis soluble (TS) and from membrane (TM) heterologous antigenic fractions by ELISA, DOT ELISA and Western blotting techniques. The ELISA test showed 95% sensitivity in both antigenic fractions and 91.8% and 93.8% specificity for TS and TM, respectively. This technique was able to detect anti-Strongyloides antibodies in 34.4% and 28.1% in S+ID group by using the TS and TM antigens, respectively. DOT ELISA was performed only with the TM fraction and showed 95% sensitivity and 85.7% specificity, detecting 28.1% positivity in S+ID group. The 40-35 KDa band was the only present in all P group individuals and the most frequent in S+ID patients (62.5% for TS and 53.1% for TM). Replicate gels were made, excised in the protein identification regions and submitted to protein identification by mass spectrometry. The most abundant proteins in TS and TM antigenic fractions were actin and galectin. TS antigen was purified on a galectin affinity column, due the immune modulation ability. The non-bound (NL) and galectin (Gal) fractions were used as antigens in the ELISA technique with 90% of sensitivity and 89.8 and 75% of specificity for NL and Gal, respectively. 34.4% and 18.1% of S+ID group were positive in the ELISA by NL and Gal fractions, respectively. Serological techniques using antigenic variations are an important alternative diagnostic tool and can be applied to human strongyloidiasis, especially in the immunocompromised population
 
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Data de Publicação
2019-04-17
 
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