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Tese de Doutorado
DOI
10.11606/T.46.2005.tde-10042007-131454
Documento
Autor
Nome completo
Wagner Ricardo Montor
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Paulo, 2005
Orientador
Banca examinadora
Sogayar, Mari Cleide (Presidente)
Novello, José Camillo
Ramos, Carlos Henrique Inácio
Ulrich, Alexander Henning
Ventura, Armando Morais
Título em português
Uso de técnicas de proteoma e genoma funcional para revelar as bases moleculares da ação anti-tumoral de ácido retinóico
Palavras-chave em português
Cancer
Eletroforese bidimensional
Espectrometria de massa
Glioma
Linhagens celulares
Proteoma
Resumo em português
Controlar a proliferação celular de tumores é um objetivo que vem sendo perseguido há décadas, com moderado sucesso na maioria dos casos. Dentre os diversos tipos de tumores que atingem a humanidade, alguns gliomas são considerados os mais fatais, por haver pouca ou nenhuma alternativa de tratamento efetivo. Agentes que apresentam propriedades anti-tumorais, como glicocorticóides (GC) e a forma all-trans do ácido retinóico (ATRA) são utilizados como adjuvantes no tratamento de alguns tipos de glioma. Entretanto, apesar de serem moléculas bastante conhecidas, pouco se sabe sobre seu mecanismo de ação como anti-tumoral. Para endereçar este problema, nosso laboratório se propôs a isolar e caracterizar genes regulados por estes agentes, utilizando modelos celulares, como as linhagens C6 e ST1 de glioma de rato, e as linhagens T98G e A172 de glioma humano. A linhagem C6 apresenta características de células transformadas e tumorais em cultura, e responde a GC, ou ATRA, com inibição de crescimento e achatamento celular. A linhagem ST1, variante derivado da C6, é hiper-responsiva ao tratamento com GC e, aparentemente, mais responsiva ao tratamento com ATRA, passando por um processo de completa reversão fenotípica tumoral-normal, devido ao expressivo aumento do tempo de dobramento, diminuição da densidade de saturação, recuperação da dependência de fatores de crescimento presentes no soro fetal bovino e da dependência de ancoragem para proliferação e perda do potencial tumorigênico, além de sofrer alterações morfológicas, como um maior achatamento celular e reorganização em feixes paralelos, que a aproximam do fenótipo normal. No presente trabalho buscou-se alterações moleculares induzidas por ATRA em células ST1, para melhor compreender a cascata de eventos desencadeada por ação deste fármaco. Em paralelo foram realizados estudos da ação de ATRA sobre as células T98G, buscando-se correlacionar os dados obtidos em modelo celular murino com modelos humanos. Para tanto, duas metodologias de estudo foram aplicadas: a) análise proteômica através de eletroforese bidimensional de proteínas (2D-PAGE), acoplada à espectrometria de massa (MALDI-TOF), para gerar perfis de expressão protéica na ausência e na presença de ATRA, permitindo comparação e identificação de proteínas moduladas no processo; b) construção de vetores plasmideais e retrovirais para super-expressar ou bloquear a expressão de um inibidor de serina protease de rato (serpinb6), descrito previamente no laboratório como estando potencialmente envolvido no processo de reversão fenotípica de ST1 induzido por ATRA. A abordagem proteômica permitiu a identificação de sete proteínas potencialmente reguladas por ATRA no modelo celular ST1, como as proteínas envolvidas em proliferação celular (c-Fos e SCGF), as proteínas de citoesqueleto (actina e tubulina), as proteínas envolvidas em estresse celular (GRP78 e Hsc70) e a proteína TCTP, classicamente reprimida em processos de reversão do fenótipo tumoral. O uso de construções plasmideais e retrovirais permitiu a obtenção de populações celulares que super-expressam serpinb6 e a análise de fenótipo destas células indicou que serpinb6 também pode ter função citoprotetora em células ST1, o que a coloca junto com as proteínas GRP78 e Hsc70 identificadas, evidenciando a importância desta classe de proteínas no processo estudado.
Título em inglês
Use of proteomics and functional genomics to unravel the molecular mechanisms of retinoic acid as an anti-tumor agent
Palavras-chave em inglês
Bidimensional electrophoresis
Cancer
Cell based assays
Functional genomics
Glioma
Mass spectrometry
Proteomics
Resumo em inglês
Control of tumor cell proliferation is an objective that has been pursued for decades, with modest or no success in the majority of the cases. Among the several kinds of tumors that develop in humans, some gliomas are considered the most fatal, due to the lack of alternatives for effective treatment. Anti-tumor agents, such as glucocorticoids (GC) or all-trans retinoic acid (ATRA) are used in combination with other drugs in some glioma cases. However, besides being very known molecules, their anti-tumor mechanism is not completely understood. In order to address this problem, our laboratory decided to isolate and characterize genes regulated by these agents, using cellular models, such as the C6 and ST1 rat glioma cell lines and the T98G and A172 human glioma models. The C6 cell line is fully transformed and tumoral in culture and responds to GC or ATRA treatment, showing growth inhibition and cell flattening. The ST1 variant is hyper-responsive to the treatment with GC and, apparently, more responsive to the treatment with ATRA, when compared to C6. Upon treatment with these agents, it undergoes a complete tumoral to normal phenotypic reversion, characterized by an increase in doubling time, decrease of saturation density in culture, recovery of dependence of serum factors for proliferation and anchorage for colony formation, besides inhability to form tumors in nude mice and morphological changes. Here we present the efforts undertaken towards better understanding of the molecular changes induced by ATRA in ST1 cells. Aiming at the correlation of the data obtained from a rat model with human models, all the studies were performed in parallel with the T98G human glioma cell model. To this end, two study methodologies were applied: a) proteomic analysis through bidimensional electrophoresis coupled to MALDI-TOF identification, to generate protein expression profiles in the presence and absence of ATRA, allowing comparison and identification of proteins modulated in the process; b) construction of plasmid and retroviral vectors to overexpress or block the expression of a serine protease inhibitor (serpinb6), previously described in the laboratory as being potentially involved in the process of tumoral to normal phenotypic reversion promoted by ATRA in ST1. The proteomics approach allowed the identification of seven proteins potentially regulated by ATRA in ST1, such as the proteins involved in cell proliferation (c-Fos and SCGF), cytoskeleton organization (actin and tubulin), cellular stress (GRP78 and Hsc70) and the tumor related protein TCTP, classically repressed in tumoral to normal reversions, and related to the three groups of proteins mentioned above. By using plasmid and retroviral vectors it was possible to obtain recombinant cell populations over-expressing serpinb6. The phenotype analysis of these populations indicated that serpinb6 can also have cell protection effects in ST1, which would classify it together with GRP78 and Hsc70 as an anti-stress protein highlighting the importance of this protein class in the process studied.
 
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Data de Publicação
2007-04-13
 
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