• JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
 
  Bookmark and Share
 
 
Tese de Doutorado
DOI
10.11606/T.43.2008.tde-20032009-101046
Documento
Autor
Nome completo
Leandro Ramos Souza Barbosa
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Paulo, 2008
Orientador
Banca examinadora
Itri, Rosangela (Presidente)
Borges, Júlio César
Coutinho, Kaline Rabelo
Fantini, Marcia Carvalho de Abreu
Mascarenhas, Yvonne Primerano
Título em português
Estudo de sistemas de relevância biológica por espalhamento de raios X a baixos ângulos
Palavras-chave em português
Espalhamento de raios-X a baixos ângulos
fármacos fenotiazínicos
interação entre proteínas
potenciais de interação
sistemas micelares
Resumo em português
Neste trabalho, utilizamos a técnica de espalhamento de raios-X a baixos Ângulos (SAXS) para estudar a influência de dois derivados fenotiazínicos na estrutura de sistemas micelares, assim como suas propriedades de auto-associação, além de investigar a influência da variação de pH e de concentração nas interações entre proteínas em solução. Para tanto, utilizamos dois fármacos fenotiazínicos, (Trifluoperazina, TFP e a Clorpromazina, CPZ), em presença de L--fosfatidilcolina (LPC), um surfactante zwiteriônico (30 mM), a pH 4.0 e 7.0. Os resultados de SAXS indicam que a micela de LPC, em ausência de fenotiazina, pode ser representada por uma micela com forma elipsoidal (com razão axial 1.6 0.1). No entanto, em presença de TFP e de CPZ a forma da micela se altera, passando para um cilindro (com razão axial 2.5 0.1). Este efeito é acompanhado por uma diminuição do raio parafínico da micela (22.5 0.3 Å), em ausência de fármaco, para 20.0 0.5 em presença de 10 mM de fármaco. Em paralelo, realizamos medidas de EPR (Ressonância Paramagnética eletrônica) destes sistemas. Combinando os resultados de SAXS e de EPR, propusemos um sítio para a localização destes compostos nas micelas de LPC, que seria na interface polar/apolar da mesma. Em um segundo momento, utilizamos as técnicas de SAXS e de EPR para investigar as características estruturais dos agregados formados por TFP e CPZ (a 20 e 60 mM, a pH 4.0 e 7.0). As curvas de SAXS são compatíveis com o espalhamento de agregados pequenos com diferentes geometrias: elipsoidal, cilíndrico e tipo-paralelepípedo. Devido à resolução da técnica, dentro do intervalo de vetores de espalhamento utilizada (até cerca de 0.3 Å-1), não é possível determinar, de forma absoluta, a correta geometria dos agregados, ou seja, todas as geometrias citadas acima ajustam de forma satisfatória as curvas de SAXS. As análises dessas curvas também não excluem a possibilidade de que estes fármacos mantenham-se como nano-cristais em solução (compostos por cerca de 10 celas unitárias, empilhadas na direção-z), seguindo sua estrutura cristalográfica. Medidas de EPR indicam que os auto-agregados a pH 4.0 possuem características semelhantes às micelas, mas a pH 6.5 este efeito não foi evidenciado, uma vez que ocorre uma forte interação entre a sonda e os agregados. Este fato indica que os agregados, a pH 6.5, têm um maior empacotamento, em comparação aos sistemas a pH 4.0. Por fim, utilizamos a Albumina de Soro Bovina (BSA, a 10 50 mg/ml), em diferentes pHs (2.0 9.0), para investigar os efeitos de concentração e de pH nos potenciais de interação das macromoléculas em solução. O fator de forma da proteína foi obtido através da estrutura cristalográfica da HSA (Human Serum Albumine, proteína humana homóloga a BSA), enquanto que as interações proteína-proteína foram calculadas através da relação de fechamento RPA (Random Phase Approximation). Nossos dados indicam que a BSA mantém sua estrutura terciária inalterada de pH 4.0 a 9.0, independente de sua concentração. No entanto, a pH 2.0 a proteína sofre um processo de desenovelamento, indicado pelo aumento da dimensão máxima da mesma. Nossos dados dão suporte para concluir que as interações entre as proteínas, a 10 mg/ml, são praticamente desprezíveis, exceto para os sistemas compostos a pH 2.0 (onde a proteína está desenovelada) e a pH 4.0 (onde evidenciamos a presença de interferência atrativa entre as proteínas). Entretanto, a medida em que aumentamos a concentração proteica, uma função de interferência do tipo repulsiva aparece na curvas de SAXS (para os sistemas de pH 4.0 a 9.0). Além disso, no sistema composto por BSA, pH 5.4 e 50 mg/ml, evidenciamos a existência de monômeros e dímeros em solução, provavelmente devido a proximidade do ponto isoelétrico da proteína (entre 4.8 5.6). Este efeito não foi evidenciado para os outros pHs, nesta mesma concentração. A pH 2.0 (25 e 50 mg/ml) evidenciamos uma compactação da proteína, sendo que sua forma é diferente da forma nativa da BSA. Nestas condições, é possível que a proteína tenha alcançado um estado molten globule, como evidenciado em outros trabalhos. Acreditamos que os efeitos de volume excluído são de grande importância para a estabilidade da proteína in vivo.
Título em inglês
Small angle x-Ray scattering study of biological relevant systems
Palavras-chave em inglês
micelles
phenothiazines
protein-protein interaction
Small angle x-ray scattering
Resumo em inglês
In this work we study, mainly by means of small angle X-ray scattering (SAXS), the influence of two phenothiazine derivatives on biomimetic systems as well as the self-assembly features. At the same time, the conformational stability of proteins in the presence of denaturant agents (pH and concentration) was evaluated. First of all, the phenothiazine compounds trifluoperazine (TFP) and chlorpromazine (CPZ) with micelles of the zwitterionic surfactant L--lysophosphatidylcholine (LPC), at pHs 4.0 and 7.0, are reported. The SAXS results demonstrate that, upon addition of both phenothiazines, the LPC micelle of prolate ellipsoidal shape changes into a cylindrically shaped micelle, increasing its axial ratio from 1.6 0.1 (in the absence of drug) to 2.5 0.1 (for 5 and 10 mM of phenothiazine). Such an effect is accompanied by a shrinking of the paraffinic shortest semiaxis from 22.5 0.3 to 20.0 0.5 Å. Besides, EPR (Electronic Paramagnetic Resonance) evidenced a bigger motion immobilization of the nitroxe probe, in the presence of phenothiazines. Our results provide evidence that the positively charged phenothiazine molecule must be accommodated near the hydrophobic/hydrophilic inner micellar interface. Furthermore, SAXS and EPR experiments were carried out to investigate the structure of the self-aggregates of CPZ and TFP, in aqueous solution. SAXS studies (drug solutions of 20 and 60 mM, at pH 4.0 and 7.0) evidenced that several different particle form factors with a homogeneous electron density distribution, in respect to the water environment, could reproduce the scattering curves. Due to the limitation of scattering intensity in the q range above 0.15 Å-1, precise determination of the aggregate shape was not possible and all of the tested models for ellipsoids, cylinders, or parallelepipeds fitted the experimental data equally well. The SAXS data allows inferring, however, that CPZ molecules might self-assemble in a basis set of an orthorhombic cell, remaining as nanocrystallites in solution. Such nanocrystals are composed of a small number of unit cells (up to 10, in c-direction), with CPZ aggregation numbers of 60-80. EPR spectra of 5- and 16-doxyl stearic acids bound to the aggregates were also performed, indicating a micelle-like aggregate at pH 4.0, and a significant motional restriction of the nitroxide was observed at pH 6.5. This implies that the aggregate is densely packed at this pH and that the nitroxide is tightly bound to it producing a strongly immobilized EPR spectrum. Finally, the effect of concentration and pH on the protein-protein interactions of BSA (Bovine Serum Albumin, from 10 up to 50 mg/ml) was evaluated by SAXS. Our results give support to infer that BSA keeps its native shape (similar to the Human Serum Albumin, HSA, crystallographic structure) unaltered at middle-acid (pH 4.0) up to basic pHs (9.0). At pH 2.0, however, BSA undergoes an unfolding process, indicated by a non globular shape. The protein-protein interactions were analysed into the Random Phase Approximation. The results show that at smaller amounts of BSA (10 mg/ml) the interference effects are not significative over the SAXS curve for pH 5.4 up to 9.0. At pH 4.0 and 10 mg/ml, however, an attractive potential takes place over the SAXS curves, that becomes repulsive with increasing BSA concentration. Besides, at pH 5.4 and 50 mg/ml, we evidenced a dimer-monomer co-existence in the solution. At pH 2.0 and 25 and 50 mg/ml, BSA undergoes to a compact conformation. Probably, BSA is in a molten globule state. Our results give also support to infer that probably, the exclude volume effect plays an important role on the protein stability in vivo.
 
AVISO - A consulta a este documento fica condicionada na aceitação das seguintes condições de uso:
Este trabalho é somente para uso privado de atividades de pesquisa e ensino. Não é autorizada sua reprodução para quaisquer fins lucrativos. Esta reserva de direitos abrange a todos os dados do documento bem como seu conteúdo. Na utilização ou citação de partes do documento é obrigatório mencionar nome da pessoa autora do trabalho.
TeseFinal1.pdf (5.33 Mbytes)
Data de Publicação
2009-04-06
 
AVISO: O material descrito abaixo refere-se a trabalhos decorrentes desta tese ou dissertação. O conteúdo desses trabalhos é de inteira responsabilidade do autor da tese ou dissertação.
  • BARBOSA, L. R. S., et al. Interaction of Phenotiazine Compounds with Zwitterionic Lysophosphatylcholine micelles: Small Angle X-ray Scattering (SAXS), Electronic Absorption Spectroscopy and Theoretical Calculations. Journal of Physical Chemistry. B, 2006, vol. 110, p. 13086-13093.
  • BARBOSA, L. R. S., et al. Self-assembling of phenothiazine compounds investigated by Small Angle X-Ray Scattering (SAXS) and Electron Paramagnetic Resonance (EPR) spectroscopy [doi:10.1021/jp710332t]. Journal of Physical Chemistry. B [online], 2008, vol. 112, p. 4261-4269.
  • Barbosa, Leandro R.S., et al. The Importance of Protein-Protein Interactions on the pH-Induced Conformational Changes of Bovine Serum Albumin: A Small-Angle X-Ray Scattering Study [doi:10.1016/j.bpj.2009.09.056]. Biophysical Journal [online], 2010, vol. 98, p. 147-157.
  • CAETANO, W, et al. Trifluoperazine effects on anionic and zwitterionic micelles: a study by small angle X-ray scattering. Journal of Colloid and Interface Science, 2003, vol. 260, p. 414-422.
  • ITRI, R., et al. Effect of urea on bovine serum albumin in aqueous and reverse micelle environments as investigated by small angle X-ray scttering, fluorescence and circular dichroism. Brazilian Journal of Physics, 2004, vol. 34, nº 1, p. 58-63.
  • SANTIAGO, P. S., et al. Interaction of meso-tetrakis(4-sulfonatophenyl)porphyrin with cationic CTAC micelles investigated by small angle X-ray scattering (SAXS) and electron paramagnetic resonance (EPR) [doi:10.1016/j.jcis.2007.08.010]. Journal of Colloid and Interface Science [online], 2007, vol. 316, p. 730-740.
  • BARBOSA, L R S, et al. Trifluoperazine and Chlorpromazine Interaction With Zwitterionic Lysophosphatidylcholine LPC Micelles Evidenced by SAXS. In 14a. Reunião Anual de Usuários do LNLS, Campinas., 2004. Libro de Resumos da 14a. Reunião Anual de Usuários., 2004. Abstract.
  • BARBOSA, L R S, and ITRI, R. Protein Conformation under influence of denaturant agents by SAXS and DSC. In Workshop on Biocalorimetry and Biological Thermodynamics, Rio de Janeiro, 2006. livro de resumos., 2006. Abstract.
  • BARBOSA, L, CAETANO, W, e ITRI, R. Interação de Fármacos Fenotiazínicos com Micelas Zwiteriônicas de LPC: um estudo por espalhamento de raios-x a baixos ângulos. In XXVII Encontro Nacional de Física da Matéria Condensada, Poços de Caldas., 2004. Livro de Resumos do XXVII Encontro Nacional de Física da Matéria Condensada., 2004. Resumo.
  • BARBOSA, L. R. S., et al. Protein conformation under influence of denaturant agents, urea and anionic surfactant SDS, as evidenced by Small Angle X-Ray scattering. In Proteins at work, Perúgia, 2007. abstract book., 2007. Abstract.
  • BARBOSA, L. R. S., et al. SEMI EMPIRICAL AND DENSITY FUNCTIONAL THEORY CALCULATIONS AND MONTE CARLO SIMULATIONS ON THE STRUCTURE OF CHLORPROMAZINE IN THE GAS PHASE AND AQUEOUS SOLUTIONS. In SBPMAT - Sociedade Brasileira de Pesquisa de Materiais, Florianópolis, 2006. livro de resumos., 2006. Resumo.
  • BARBOSA, L. R. S., et al. The importance of protein-protein interactions on the pH-induced conformational changes of Bovine Serum Albumin: a Small Angle X-Ray Scattering Study. In Biophysical Meeting, San Francisco, 2010. Biophysical Journal., 2010. Abstract.
  • BARBOSA, L. R. S., et al. The influence of urea and pH variation on the BSA structure: a Small Angle x-Ray Scattering Study. In Neutrons in Biology, Oxford, 2007. abstract book., 2007. Abstract.
  • BARBOSA, L. R. S., e ITRI, R. Simulação de curvas de espalhamento de raios X a baixos ângulos (SAXS) de proteínas em solução. In 10. Simpósio Internacional de Iniciação Científica da USP - SIICUSP, São Carlos, 2002. Livro de Resumos do 10 SIICUSP., 2002. Resumo.
  • BARBOSA, L., e ITRI, R. Estudo da Conformação de Proteínas na Presença de Uréia e Surfactantes. In XXVI Encontro Nacional de Física da Matéria Condensada, Caxambu, 2003. Livro de Resumos do XXVI ENFMC.São Paulo : SBF, 2003. Resumo.
  • BARBOSA, Leandro Ramos, CAETANO, Wilder, e ITRI, R. Interação de Fármacos Fenotiazínicos com Micelas Zwiteriônicas de LPC: um estudo por espalhamento de raios X a baixos ângulos. In XIX Simpósio Internacional de Iniciação Científica da USP, São Carlos, 2003. Livro de Resumos do XIX SIICUSP., 2003. Resumo.
  • CAETANO, Wilker, BARBOSA, L. R. S., e ITRI, R. Auto-Associação e Interação de Fármacos Fenotiazínicos com MielasZwiteriônicas de HPS Investigadas por Espalhamento de Raios-X em ângulos Baixo (SAXS). In XXI Encontro Nacional de Física da Matéria Condensada, Caxambú, 2002. Livro de Resumo do XXV ENFMC., 2002. Resumo.
  • TABAK, M., et al. Porphyrin effects on ionic micelles as investigated by small angle X-Ray scattering (SAXS) and electron paramagnetic resonance (EPR). In International Conference on Porphyrins and Phthalocyanines - ICPP-4, Roma, 2006. Journal of Porphyrins and Phthalocyanines,2008., 2006. Resumo.
Todos os direitos da tese/dissertação são de seus autores
Centro de Informática de São Carlos
Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP. Copyright © 2001-2018. Todos os direitos reservados.