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Tese de Doutorado
DOI
10.11606/T.43.2018.tde-08052018-005348
Documento
Autor
Nome completo
Daniela Akiko Nomura
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Paulo, 2018
Orientador
Banca examinadora
Lamy, Maria Teresa Moura (Presidente)
Alencar, Adriano Mesquita
Louro, Sonia Renaux Wanderley
Oliveira, Cristiano Luis Pinto de
Rozenfeld, Julio Henrique Kravcuks
Título em português
Caracterização estrutural de dispersões aquosas de lipídios aniônicos
Palavras-chave em português
Biofísica Molecular
dispersões lipídicas
DMPG
lipídio aniônico
membranas modelo
Resumo em português
É conhecido que a força iônica do meio desempenha um papel fundamental na estrutura de vesículas aniônicas de DMPG (dimiristoil fosfatidilglicerol) em dispersões aquosas. A baixa força iônica (~ 6 mM), as dispersões de DMPG exibem várias características anômalas, que foram interpretadas como a abertura de poros na bicamada ao longo da larga região de transição de fase gel-fluida (de ~ 18°C a 30°C). Aqui, revisitamos o sistema de DMPG em tampão a baixa força iônica, mas com dispersões obtidas após a extrusão por filtros de 100 nm, portanto menos polidispersas. Para enfatizar as interações eletrostáticas entre as cabeças polares dos lipídios, que não estarão blindadas pela presença de sais na solução, estudamos dispersões de DMPG em água pura, de modo a monitorar os agregados presentes na dispersão, e suas interações. As dispersões em água foram caracterizadas antes e depois da extrusão. Para tal, utilizamos diversas técnicas experimentais, em diferentes temperaturas: espalhamento de luz estático (SLS) e dinâmico (DLS), calorimetria diferencial de varredura (DSC), Ressonância Paramagnética Eletrônica (RPE) de marcadores de spin incorporados aos agregados, espalhamento de raios-X a altos e baixos ângulos (WAXS e SAXS), e medidas de viscosidade, turbidez, mobilidade eletroforética e condutividade elétrica. Resultados das várias técnicas com dispersões extrusadas de DMPG em tampão mostraram que o comportamento anômalo é observado de forma similar ao de dispersões não extrusadas. Entretanto, o pico de SAXS em muito baixo ângulo é visto de 5 a 45°C, e não apenas na região de transição de fase, portanto não deve ser modelado como a distância entre poros na bicamada lipídica que se abririam nesta região. A distância de repetição relacionada a este pico diminui na região de transição de fase, e com o aumento da concentração lipídica. Medidas de DSC indicaram que, em água, a região de transição de fase da vesícula de DMPG é ainda mais ampla, começando em torno de 10°C, mas ainda terminando em ~ 30oC. No entanto, a alta condutividade elétrica, viscosidade, mobilidade eletroforética, raio efetivo, e a baixa turbidez, vistas apenas na região de transição de fase do DMPG em tampão, são encontradas até altas temperaturas em água, quando a bicamada lipídica já se encontra na fase fluida. Medidas de RPE e WAXS mostraram a transição da membrana de uma fase mais rígida/imóvel/organizada para uma fase mais frouxa/móvel. Dados de espalhamento de luz, RPE e SAXS mostram que, similar ao DMPG em tampão, em água, o DMPG organiza-se como vesículas esféricas, unilamelares, mas possivelmente menores e mais carregadas, exibindo fortes interações vesícula-vesícula. Nas medidas de SAXS, o pico de Bragg na região de muito baixo ângulo foi visto em todas as temperaturas (de 5 a 60°C), sendo que a distância de repetição diminui para temperaturas maiores do que 10oC. Os resultados obtidos para dispersões em água, reforçam o comportamento anômalo observado anteriormente para dispersões em tampão em baixa força iônica. De acordo com eles, propomos a existência de vesículas altamente deformadas e ionizadas a partir de uma certa temperatura, T1 para o DMPG em água e Tmon em tampão baixa força iônica, sendo que em água a forte repulsão eletrostática PG--PG- levaria a fortes deformações e interações vesícula-vesícula, em uma ampla extensão de temperaturas.
Título em inglês
Structural characterization of aqueous dispersions of anionic lipids
Palavras-chave em inglês
anionic lipids
DMPG
lipid dispersions
model membranes
Molecular Biophysics
Resumo em inglês
It is known that the ionic strength plays a fundamental role in the structure of DMPG (dimyristoyl phosphatidylglycerol) anionic vesicles in water medium. At low ionic strength (~ 6 mM), DMPG dispersions display several anomalous characteristics, which were interpreted as the opening of bilayer pores along the wide bilayer gel-fluid transition region (from ~ 18°C to 30°C). Here, we revisit DMPG in buffer at low ionic strength, but with dispersions obtained after the extrusion by 100 nm filters, thus less polydisperse. To emphasize electrostatic interactions between the polar head-groups, which will not be shielded by ions in solution, we studied DMPG dispersions in pure water to monitor the aggregates in the dispersion and their interactions. Water dispersions were characterized before and after extrusion. For such, we used several experimental techniques, at different temperatures: light scattering, both static (SLS) and dynamic (DLS); differential scanning calorimetry (DSC); electron spin resonance (ESR) of spin labels incorporated into the aggregates, Small and Wide Angle X-Ray Scattering (SAXS and WAXS); and viscosity, turbidity, electrophoretic mobility and electrical conductivity measurements. Several techniques with extruded dispersions of DMPG in buffer showed that the anomalous behavior is also observed. However, the SAXS peak at very low angles is seen from 5 to 45°C, and not only in the phase transition region, therefore it should not be modeled as the distance of correlated pores in the lipid bilayer that would open in this region. The repeating distance related to this peak decreases in the phase transition region, and with increasing lipid concentration. DSC indicates that, in water, the bilayer gel-fluid transition is even wider, starting around 10oC but still ending ~ 30oC. However, high electric conductivity, viscosity, electrophoretic mobility, effective radius and low turbidity found only in the gel-fluid transition region for DMPG in buffer, are found at higher temperatures in water, when lipid bilayers are already in the fluid state. ESR and WAXS measurements evidenced the transition of the membrane from a more rigid/immobile/organized phase to a more soft/mobile phase. Light scattering, ESR and SAXS data showed that, similar to DMPG in buffer, in water, DMPG is organized as spherical unillamelar vesicles, but possibly smaller, highly charged, displaying strong vesicle-vesicle interactions. With SAXS the Bragg peak at very low angles was seen at all temperatures (from 5 to 60°C) with the repetition distance decreasing at temperatures higher than 10 ° C. The results obtained for water dispersions reinforce the anomalous behavior previously observed for buffer at low ionic strength dispersions. According to them, we propose the existence of highly deformed and ionized vesicles from a certain temperature, T1 for DMPG in water and Tmon in buffer at low ionic strength. In water the strong PG- - PG- electrostatic repulsion would lead to strong deformations and vesicle-vesicle interactions, over a wide range of temperatures.
 
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Data de Publicação
2018-05-11
 
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