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Dissertação de Mestrado
DOI
10.11606/D.17.2018.tde-13092018-145344
Documento
Autor
Nome completo
Izabela Aparecida Lopes
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
Ribeirão Preto, 2018
Orientador
Banca examinadora
Pontes, Lorena Lôbo de Figueiredo (Presidente)
Pagnano, Katia Borgia Barbosa
Traina, Fabíola
Rodrigues, Maria Carolina de Oliveira
Título em português
Identificação dos mecanismos de regulação das células Natural Killer pelo fator de transcrição C/EBPG (CCAAT/enhancer binding protein gamma)
Palavras-chave em português
Fator de transcrição C/EBPG ; Células Natural Killer ; 3. IFNy
Resumo em português
Os C/EBP (CCAAT/enhancer-binding proteins) são uma família de fatores de transcrição implicados numa variedade de processos da hematopoese, regulando tanto a diferenciação terminal como a proliferação celular. Dentre estes, sabe-se que o C/EBP gamma (C/EBPG) está envolvido na maturação funcional de células Natural Killer (NK). Entretanto, os mediadores dessa regulação não são conhecidos. As células NK são linfócitos com funções efetoras de citotoxicidade e de produção de citocinas, dependentes de um equilíbrio dinâmico entre a expressão de receptores ativatórios e inibitórios bem como de receptores de citocinas. As duas funções (citotóxica e secretora), fazem das células NK importantes componentes da hematopoese, capazes de eliminar alvos susceptíveis bem como de recrutar outras células e amplificar a resposta inflamatória. Diante de incompatibilidade entre as células-alvo e células NK efetoras, os efeitos citotóxicos preponderam; enquanto na ausência de incompatibilidade, os efeitos mediados por citocinas sobre as demais células hematopoéticas se sobressaem. Por exemplo, citocinas como IFN?, TNF?, TGF?, GM-CSF e IL-10, produzidas por células NK, são potenciais reguladoras da função das células-tronco hematopoéticas (CTH). Com o objetivo de estudar a regulação das células NK pelo C/EBPG, utilizamos células NK isoladas de animais transgênicos knockout (KO) para o C/ebpg e seus controles para analisar sua expressão gênica e função diferencial, com especial foco nos genes-alvo com potencial para regulação da hematopoese. Visando identificar potenciais genes-alvo do C/EBPG, isolamos células NK deficientes para o C/ebpg e controles, por meio de sorting, e realizamos posterior isolamento do RNA seguido de análise de expressão gênica em larga escala. A validação da expressão diferencial dos genes-alvo do C/ebpg, de interesse para a função secretória das células NK, foi realizada por PCR em Tempo Real para oito genes diferencialmente expressos na análise de expressão gênica em larga escala, a saber: Il-10, Gmcsf, Ifng, Tnfa, Tgfb, Tlr4, Myd88 e Irak4. Os dados referentes à expressão basal e estimulada com IL-2, destes genes em células NK de animais KO para o C/ebpg e seus controles, revelaram uma tendência ao aumento da expressão de Myd88 nos animais KO quando comparados aos controles. Foram verificados os níveis das citocinas IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A, TNF? and IFN? por meio de citometria de fluxo, utilizando o sobrenadante da cultura de NK de ambos os animais, observando-se que, após a ativação com IL-2, a produção de IFN? mostrou-se diminuída em células NKdeficientes para o C/ebpg em comparação aos controles. Para caracterizar as células NK Cebpg-deficientes, analisamos a sua frequência (células linhagem-/CD3- /NK1.1+) e expressão dos receptores NKG2D, Ly49D e NKG2A, não sendo observadas diferenças numéricas ou de expressão de receptores entre células NK deficientes ou não para o C/ebpg. Os subtipos funcionais destas células foram caracterizados de acordo com a expressão de CD27 e CD11b, que permitem identificar as subpopulações de células NK imaturas secretórias, secretórias, citotóxicas e tolerantes. Os animais KO mostraram maior percentagem de células secretórias e redução percentual e numérica de células citotóxicas quando comparadas às células NK dos controles. Para demonstrar a deficiência funcional realizamos um ensaio de ativação de células. Em concordância, após a coincubação de esplenócitos totais com células YAC-1, o ensaio de detecção do CD107 revelou que as células dos animais KO para o C/ebpg são cinco vezes menos ativadas do que células NK controles. Ademais, foi realizado um ensaio de citotoxicidade por citometria de fluxo utilizando o CTO (Cell Tracker Orange) como sonda fluorescente, o qual se incorpora às células-alvo da linhagem YAC-1. Como resultado, para a razão 10:1 NK: células-alvo, as células NK C/ebpg KO foram menos citotóxicas do que as células NK dos controles. Concluímos que as células NK de animais transgênicos KO para o C/ebpg têm função deficiente, menor potencial citotóxico e expressão de genes e citocinas alteradas em relação aos seus controles. Os mediadores apontados, em especial, o IFN?, são alvos importantes para a regulação da função secretória das células NK.
Título em inglês
Identification of Natural Killer cells regulation mechanisms by the transcription factor C/EBPG (CCAAT/enhancer binding protein gamma)
Palavras-chave em inglês
C/EBPG transcription factor ; Natural Killer cells ; 3. IFNy
Resumo em inglês
C/EBP (CCAAT/enhance-binding proteins) are a family of transcription factors involved in a variety of hematopoietic processes, regulating both terminal differentiation and cellular proliferation. Among these, it is known that C/EBP gamma (C/EBPG) is involved in the functional maturation of Natural Killer (NK) cells. However, the mediators of this regulation are unknown. NK cells are lymphocytes with effector functions of cytotoxicity and production of cytokines, both dependent on a dynamic equilibrium between the expression of activating and inhibitory receptors as well as cytokine receptors. The two functions (cytotoxic and secretory) make NK cells important components of hematopoiesis, able to eliminate susceptible targets as well as recruit other cells to amplify inflammatory responses. In face of incompatibility between target cells and NK effector cells, cytotoxic effects predominate; while in the absence of incompatibility, cytokine-mediated effects that influence other hematopoietic cells prevail. For example, cytokines such as IFN?, TNF?, TGF?, GMCSF and IL-10, produced by NK cells, are potential regulators of hematopoietic stem cells (HSC). With the aim of studying the regulation of NK cells by C/EBPG, we isolated NK cells from transgenic C/ebpg knockout (KO) animals and controls to analyze their differential gene expression and function, with a special focus on hematopoiesis regulation. In order to identify potential C/EBPG target genes, we isolated C/ebpg-deficient and control NK cells by the use of sorting by flow cytometry and isolated RNA for gene expression analysis. Differential expression of C/ebpg target genes was performed by Real-time PCR for eight genes differentially expressed in the microarray analysis: Il-10, Gmcsf, Ifng, Tnfa, Tgfb, Tlr4, Myd88 e Irak4. When compared to controls, non-activated and IL-2-stimulated C/ebpg KO NK cells presented a tendency to have higher expression of Myd88. Cytokine levels of IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17?, TNF? and IFN?, obtained from NK culture supernatants, were verified by flow cytometry, after IL-2 activation. Among these cytokines, the production of IFN? by C/ebpg-deficient NK cells was found to be reduced. To further characterize NK cells, we analyzed their frequency (Lineage- /CD3-/NK1.1+ cells) and the expression of the receptors NKG2D, Ly49D and NKG2A, and both analyses presented similar expression between control or C/epbg KO NK cells. The functional subtypes of these cells were characterized according to the expression of CD27 and CD11b, which allow the identification of NK subpopulationsas immature secretory, mature secretory, cytotoxic or tolerant. The KO animals showed higher percentage of secretory cells and percentual and numerical reduction of cytotoxic cells when compared to the NK control cells. In agreement, CD107a expression was 5-times lower in C/ebpg KO splenocytes than in control splenocytes after co-incubation with YAC-1 cells. In addition, a cytotoxicity assay by flow cytometry was performed. The fluorescent probe CTO (Cell Tracker Orange) was incorporated to YAC-1 cells, used as target cells. As a result, in the 10:1 NK:target cells ratio, C/ebp KO cells were less cytotoxic than NK control cells. We concluded that C/ebpg-deficient cells are dysfunctional, have a greater secretory potential and an altered expression of genes and cytokines as compared to their controls. The potential mediators revealed by our study, in particular, IFN?, may be important targets for the regulation of NK secretory function.
 
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Data de Publicação
2018-10-05
 
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