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Tese de Doutorado
DOI
10.11606/T.17.2014.tde-19122014-154406
Documento
Autor
Nome completo
José Eduardo Peixoto Santos
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
Ribeirão Preto, 2014
Orientador
Banca examinadora
Leite, João Pereira (Presidente)
Alonso, Orfa Yineth Galvis
Cendes, Fernando
Serafini, Luciano Neder
Velasco, Tonicarlo Rodrigues
Título em português
Estudo das relações entre populações celulares, expressão de aquaporina-4 e sulfato de condroitina com o tempo de relaxamento e a taxa de transferência de magnetização no hipocampo de pacientes com epilepsia do lobo temporal farmacorresistente
Palavras-chave em português
aquaporina 4
densidade neuronal
epilepsia do lobo temporal
gliose
hipocampo
matriz extracelular
relaxometria
ressonância magnética
sulfato de condroitina
transferência de magnetização
volumetria
Resumo em português
Racional: A epilepsia do lobo temporal está comumente associada à farmacorresistência e tem a esclerose hipocampal como achado neuropatológico em mais da metade dos casos. Histologicamente, a esclerose hipocampal está associada à perda neuronal diferencial e gliose, além de alterações nos níveis de moléculas associadas à homeostase da água tecidual, como a aquaporina 4 e a molécula de matriz sulfato de condroitina. Em imagens de ressonância nuclear magnética, a esclerose é caracterizada por redução de volume em sequências ponderadas em T1, aumento de sinal e tempo de relaxamento em sequências ponderadas em T2 e redução na transferência de magnetização. Justificativa e Objetivos: Uma vez que tanto o sinal T2 quando a transferência de magnetização são dependentes da água tecidual, nosso objetivo é avaliar, na formação hipocampal de pacientes com epilepsia do lobo temporal, as correlações entre populações celulares e moléculas ligadas à homeostase da água e as imagens ponderadas em T2 e transferência de magnetização. Visamos ainda definir, na formação hipocampal de indivíduos sem alterações neuropatológicas, o volume de cada um dos subcampos hipocampais. Metodologia: Pacientes com epilepsia do lobo temporal farmacorresistente (ELT, n = 43), bem como voluntários sadios (controle radiológico, CH, n = 20), foram submetidos a exames de ressonância magnética em máquina de 3T para mensuração da volumetria hipocampal, tempo de relaxamento T2 e transferência de magnetização hipocampal (exames in vivo). Após o tratamento cirúrgico para o controle das crises, os hipocampos dos pacientes com ELT foram fixados por 8 dias e submetidos aos exames ex vivo em máquina de 3T para cálculo do tempo de relaxamento T2 de cada subcampo hipocampal. Hipocampos controle (Controle historadiológico, CHR, n = 14), foram obtidos de autópsias de pacientes sem histórico ante-mortem de doença neurológica ou presença de patologia no exame do encéfalo pos mortem. Ambos os grupos controle foram pareados para idade em relação ao grupo ELT. Alguns dos casos CHR (n = 6) foram também submetidos à imagem 3D T2 em máquina de 4,7T para cálculo de volumetria dos subcampos hipocampais. Após emblocamento em parafina, secções coronais hipocampais dos casos CHR e ELT foram submetidas às técnicas de histoquímica básica Hematoxilina e Eosina e Luxol Fast Blue, e às imuno-histoquímicas para avaliação das populações neuronais (NeuN), astrócitos reativos (GFAP), micróglias ativadas (HLA-DR) e para a expressão de aquaporina 4 (AQP4) e níveis de sulfato de condroitina (CS-56). Para a comparação entre os grupos, foram realizados testes t para dados paramétricos e Mann-Whitney para dados não-paramétricos. Testes de correlação foram empregados para análise da associação entre as avaliações histológicas e os exames de ressonância magnética. Resultados: Pacientes com ELT apresentaram menor volume hipocampal, maior tempo de relaxamento T2 e menor transferência de magnetização no exame in vivo, quando comparados com o CR. O exame ex vivo para a volumetria dos subcampos hipocampais em casos do grupo CHR indicou que a fascia dentata, a região CA1 e o subículo correspondem à 85 % do volume hipocampal total. Quanto ao tempo de relaxamento T2 ex vivo, foi observado aumento em todos os subcampos hipocampais do grupo ELT, à exceção da fascia dentata, quando comparados ao CHR. A avaliação da densidade neuronal indicou redução significativa em todos os subcampos dos casos ELT, à exceção do subículo, quando comparados ao CHR. Em relação aos valores do grupo CHR, foi observada astrogliose em quase todos subcampos da formação hipocampal (a exceção da zona subgranular e do hilo) e microgliose em todos os subcampos (exceto pelo subículo) dos casos com ELT. Pacientes com ELT apresentaram redução na expressão de aquaporina 4 perivascular em todos os subcampos do hipocampo, comparados ao CHR. Aumento nos níveis de sulfato de condroitina foi observado em todos os subcampos da formação hipocampal, à exceção da camada granular, nos pacientes com ELT. O volume hipocampal e a transferência de magnetização in vivo dos pacientes com ELT correlacionaram-se tanto com a população neuronal como com os níveis de sulfato de condroitina, enquanto que o tempo de relaxamento in vivo correlacionou-se com a população astroglial e os níveis de sulfato de condroitina. O exame ex vivo corroborou a correlação entre a população glial e o tempo de relaxamento observado nos pacientes com ELT. A diferença entre o tempo de relaxamento in vivo e ex vivo correlacionou-se tanto com a difusibilidade da água no tecido como com os níveis de sulfato de condroitina. Conclusões: Nossos dados indicam correlação entre a patologia hipocampal e as imagens de ressonância nuclear magnética, sendo que a maior qualidade das imagens ex vivo permitiu uma avaliação mais direta entre o sinal de ressonância e a patologia, indicando importância da população celular e matriz extracelular para o volume hipocampal e a transferência de magnetização, e da astrogliose para o tempo de relaxamento T2. Finalmente, nossos dados mostraram que CA1, subículo e fascia dentata tem grande participação no volume hipocampal, sendo que alterações nestas regiões tem um papel mais relevante nas alterações observadas na ressonância magnética, como indicado por nossas correlações.
Título em inglês
Study of the associations between cellular populations, aquaporin 4 and chondroitin sulfate with T2 relaxation and magnetization transfer in the hippocampus of patients with drug-resistant temporal lobe epilepsy
Palavras-chave em inglês
aquaporin 4
chondroitin sulfate
extracellular matrix
gliosis
hippocampus
magnetic resonance imaging
magnetization transfer
neuron density
relaxometry
temporal lobe epilepsy
volumetry
Resumo em inglês
Rationale: Drug resistant temporal lobe epilepsy is often associated with hippocampal sclerosis. Histological evaluation reveals differential neuronal loss, gliosis and changes in molecules associated with water homeostasis, such as aquaporin 4 and chondroitin sulfate. Magnetic resonance imaging in these cases often reveals hippocampal atrophy, increased T2 signal and T2 relaxation and reduced magnetization transfer ratio in the hippocampus. Aims: Once both T2 signal and magnetization transfer are affected by tissue water, our goal was to evaluate, in the hippocampus of drug-resistant temporal lobe epilepsy patients who underwent surgery for seizure control, the associations between cellular populations, aquaporin 4 and chondroitin sulfate with T2 relaxation time and magnetization transfer. Additionally, we intended to measure the individual volume of each hippocampal subfield in hippocampus from patients without neurological disease. Methods: Patients with drug-resistant temporal lobe epilepsy (TLE, n = 43) and age-matched health volunteers (radiological control, RC, n = 20) were submitted to magnetic resonance in a 3T machine for hippocampal volumetry measure, T2 relaxation and magnetization transfer (in vivo examination). After surgical treatment for seizure control, hippocampi from the TLE patients were fixed in formalin for 8 days and then submitted to ex vivo imaging in 3T for relaxation time of every hippocampal subfield. Control hippocampi were obtained from autopsies of age-matched patients without ante mortem history of neurological disease or post mortem neurological pathology, and underwent the same ex vivo imaging (histo-radiological control, HRC, n = 14). Six cases from the HRC underwent 3D T2 imaging in a 4.7T machine, in order to measure the volumes of the hippocampal subfields. Paraffin embedded hippocampal sections from TLE and HRC were submitted to Hematoxilin-Eosin and Luxol Fast Blue histochemistries, and to immunohistochemistries for the evaluation of neurons (NeuN), reactive astrocytes (GFAP), activated microglia (HLA-DR), for aquaporin 4 (AQP4) and for chondroitin sulfate (CS-56). Students t-test or Mann-Whitneys test were performed for comparison between groups, and correlation tests were performed for the comparison between histological and magnetic resonance measures. Results: Patients with TLE presented reduced hippocampal volume, increased T2 relaxation time and reduced magnetization transfer, when compared to RC. The ex vivo volumetry of the hippocampal subfields revealed that fascia dentata, CA1 and subiculum together correspond to 85 % of the total hippocampal volume. Ex vivo relaxation time, as the in vivo, were increased in the subfields of TLE patients, when compared to HRC. Compared to HRC, TLE patients presented neuron loss and microgliosis in all hippocampal subfields but the subiculum, and astrogliosis in all hippocampal subfields but the subgranule zone and the hilus. Reduced perivascular aquaporin 4 was observed in all hippocampal subfields of TLE patients, and increased chondroitin sulfate was observed in all hippocampal subfields, with the exception of granule cell layer, of TLE patients, when compared to HRC. In TLE, both in vivo hippocampal volume and magnetization transfer correlated with the levels of chondroitin sulfate and the neuronal population, whereas the in vivo relaxation time correlated with the astroglial population and the levels of chondroitin sulfate. Ex vivo relaxation time also correlated with the astroglial population in TLE patients. The difference between in vivo and ex vivo relaxation values correlated with water difusibility and the levels of chondroitin sulfate. Conclusion: Our data indicate the importance of neuron population and extracellular matrix to both hippocampal volume and magnetization transfer, and of the reactive astrocytes for T2 relaxation. Ex vivo relaxation time allowed a more detailed evaluation, and indicated more robust correlations between reactive astrocytes and T2 relaxation. Finally, Our data indicated that CA1, the subiculum and fascia dentata are the major contributors to hippocampal volume, so changes in these subfields most likely will affect magnetic resonance imaging.
 
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Data de Publicação
2015-03-16
 
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