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Tese de Doutorado
DOI
10.11606/T.17.2019.tde-22112018-084729
Documento
Autor
Nome completo
Natalia Lautherbach Ennes da Silva
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
Ribeirão Preto, 2018
Orientador
Banca examinadora
Kettelhut, Isis do Carmo (Presidente)
Baviera, Amanda Martins
Elias, Lucila Leico Kagohara
Gomes, Marcelo Damario
Moriscot, Anselmo Sigari
Título em português
Os efeitos da urocortina 2 no metabolismo de proteínas em músculos esqueléticos de roedores
Palavras-chave em português
Urocortina 2 ; Hipertrofia muscular ; Sinalização intracelular ; Autofagia
Resumo em português
A urocortina 2 (Ucn2) é um peptídeo que pertence à família dos fatores liberadores de corticotrofina (CRF) e, assim como seu receptor específico CRF2R? (corticotropin releasing factor receptor type 2?), encontram-se expressos no músculo esquelético. Embora tenha sido demonstrado que o tratamento sistêmico com Ucn2 seja capaz de induzir hipertrofia e prevenir a perda de massa muscular, nada se conhece acerca dos mecanismos moleculares através dos quais a Ucn2 desempenha suas ações biológicas. O principal objetivo deste trabalho foi investigar o mecanismo de ação da Ucn2 no músculo esquelético de roedores para o aparecimento da resposta hipertrófica e a possível participação das vias de sinalização Akt/mTOR, Akt/Foxo e ERK1/2 neste efeito anabólico. Para isto foi utilizado o modelo de transfecção in vivo da Ucn2 pelo método da eletroporação em músculos tibialis anterior de camundongos. Nestes músculos foram quantificados: 1) o estado de fosforilação de componentes efetores destas vias; 2) moléculas sinalizadoras da via autofágica; 3) a taxa de síntese proteica in vivo e 4) a expressão de genes relacionados à atrofia muscular (atrogenes). Outra metodologia utilizada para verificar o efeito direto da Ucn2 na musculatura esquelética foi a incubação in vitro de músculos soleus e EDL isolados de roedores com este peptídeo a fim de investigar a taxa de degradação proteica total, bem como a atividade dos sistemas proteolíticos lisossomal¸ ubiquitina-proteassoma e dependente de Ca+2. A superexpressão in vivo da Ucn2 por 14 dias promoveu hipertrofia e preveniu a atrofia em músculos tibialis anterior de camundongos normais e submetidos ao modelo de desnervação motora isquiática.Resumo Este crescimento muscular induzido pela Ucn2 in vivo foi associado a ativação das vias de sinalização AMPc/PKA/CREB, AMPc/Epac, Akt/mTOR/S6, Akt/mTOR/4E-BP1 e ERK1/2/eIF4E com consequente estimulação da síntese proteica. Em concordância, utilizando uma técnica de manipulação genética in vivo, demonstramos que a hipertrofia promovida pela Ucn2 é dependente da estimulação das cascatas de sinalização ativadas por Akt e ERK1/2. Ademais, essa alteração fenotípica promovida pela Ucn2 induziu melhora da resistência à fadiga muscular, sendo este impacto funcional dependentente de ERK1/2, mas não de Akt. Além disso, a superexpressão da Ucn2 induziu "shifting" para o tipo de fibra oxidativa (tipo I), sendo esta plasticidade possivelmente mediada por PGC-1?, o que pode ter contribuído pelo menos em parte, para o efeito benéfico promovido pela Ucn2 na função muscular. O efeito antiatrófico da Ucn2 in vivo foi associado à estimulação da via Akt/Foxo1,3 concomitante com a redução da atividade transcricional de Foxo, resultando na diminuição da expressão da E3-ligase atrogin-1 e do gene autofágico LC3. Em paralelo, a Ucn2 in vivo promoveu inibição do fluxo autofágico, inferido pelo acúmulo das proteínas LC3-I, LC3-II e p62 nestes músculos. Corroborando os achados in vivo, os efeitos antiproteolíticos da Ucn2 in vitro parecem ser mediados pelo AMPc e envolvem a supressão da atividade do sistema lisossomal/autofágico em músculos EDL de ratos normais. Portanto, além da participação de efetores dowsntream do AMPc, como PKA e EPAC, diferentes quinases participam dos efeitos biológicos da Ucn2 na musculatura esquelética. Esses resultados são importantes para caracterizar novas estratégias terapêuticas capazes de atuar no combate à atrofia muscular em diversas situações catabólicas.
Título em inglês
The urocortin 2 effects on protein metabolism in skeletal muscles of rodents
Palavras-chave em inglês
Urocortin 2 ; Muscular hypertrophy ; Intracellular signaling ; Autophagy
Resumo em inglês
Urocortin 2 (Ucn2) is a peptide that belongs to corticotrophin releasing factors (CRF) family and, as well as its specific receptor CRF2R? (corticotropin releasing factor receptor type 2?), are expressed in skeletal muscle. Although it has been demonstrated that Ucn2 systemic treatment is able to induce hypertrophy and prevent loss of muscle mass, nothing is known about the molecular mechanisms through which Ucn2 plays its biological actions. The main objective of this work was to investigate the Ucn2 mechanism of action in rodent skeletal muscle for the appearance of the hypertrophic response and the possible participation of Akt/mTOR, Akt/Foxo and ERK1/2 signaling pathways in this anabolic effect. For this, an in vivo transfection model of Ucn2 was used by the electroporation method in tibialis anterior muscles of mice. Were quantified in these muscles: 1) the phosphorylation state of effector components of these pathways; 2) signaling molecules of the autophagic pathway; 3) the rate of protein synthesis in vivo and 4) the expression of genes related to muscle atrophy (atrogenes). Another methodology used to verify the direct effect of Ucn2 in skeletal muscle was the incubation of soleus and EDL muscles isolated from rodents with this peptide in vitro in order to investigate the total rate of protein degradation, as well as the activity of the lysosomal, ubiquitin-proteasome and Ca+2 dependent proteolytic systems. Ucn2 overexpression in vivo for 14 days promoted hypertrophy and prevented atrophy in tibialis anterior muscles of normal mice and submitted to the sciatic motor denervation model. This muscle growth induced by Ucn2 in vivo was associated with the activation ofAbstract cAMP/PKA/CREB, cAMP/Epac, Akt/mTOR/S6, Akt/mTOR/4E-BP1 and ERK1/2/eIF4E signaling pathways with consequent stimulation of protein synthesis. In agreement, using a genetic manipulation technique in vivo, we demonstrated that the hypertrophy promoted by Ucn2 is dependent on the stimulation of the signaling cascades activated by Akt and ERK1/2. In addition, this phenotypic alteration promoted by Ucn2 induced an improvement in muscle fatigue resistance, being this functional impact dependent on ERK1/2, but not on Akt. Moreover, Ucn2 overexpression in vivo induced the shift to type I oxidative fiber, and this plasticity is possibly mediated by PGC-1?, which may have contributed at least in part to the beneficial effect promoted by Ucn2 in muscle function. The anti-atrophic effect of Ucn2 in vivo was associated with the stimulation of Akt/Foxo1,3 pathway concomitant with the reduction of Foxo transcriptional activity, resulting in a decrease in the expression of the atrogin-1 E3-ligase and of the autophagic gene LC3. In parallel, Ucn2 in vivo promoted inhibition of autophagic flow, inferred by the accumulation of LC3-I, LC3-II and p62 proteins in these muscles. Corroborating the in vivo findings, the antiproteolytic effects of Ucn2 in vitro appear to be mediated by cAMP and involve the suppression of lysosomal/autophagic system activity in EDL muscles of normal rats. Thus, in addition to the participation of cAMP dowsntream effectors, such as PKA and EPAC, different kinases participate in the biological effects of Ucn2 on skeletal muscle. These results are important to characterize new therapeutic strategies able to prevent muscular atrophy in several catabolic situations.
 
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Data de Publicação
2019-01-21
 
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