O Peptídeo Relacionado ao Gene da Calcitonina (CGRP) é um potente peptídeo vasodilatador amplamente distribuído no sistema nervoso central e em vários tecidos periféricos, incluindo o músculo esquelético e cardíaco. Estudos recentes do nosso laboratório demonstraram que este neuropeptídeo exerce efeitos antiproteolíticos no músculo esquelético e na manutenção da junção neuromuscular em ratos. No entanto, seu papel modulatório no controle do metabolismo de proteínas no coração ainda é completamente desconhecido. O objetivo principal deste estudo foi avaliar os efeitos agudos in vivo do CGRP na autofagia cardíaca. Para isso, camundongos C57Bl6 machos receberam uma única injeção de CGRP (100 ?g/Kg, via subcutânea) ou solução salina 0,9% e foram sacrificados após 15, 30 ou 60 minutos. Nestes períodos, foram analisados metabólitos, hormônios, marcadores da autofagia cardíaca e o estado de fosforilação de proteínas relacionadas ao controle da síntese e degradação de proteínas. Os efeitos do CGRP no fluxo autofágico foram estimados por meio do tratamento com colchicina (0,4 mg/Kg, via intraperitoneal) em camundongos alimentados ou submetidos a 24h de jejum (CEUA, 018/2010, FMRP-USP). O sangue foi coletado e os corações foram removidos para posterior análises bioquímicas, de imunoreatividade, imunofluorescência e de expressão gênica. As catecolaminas foram quantificadas por HPLC. Os resultados foram expressos como média±EPM e para análise estatística foi aplicado o teste ANOVA com nível de significância de 5%. Em camundongos alimentados, o CGRP aumentou a glicemia (~55%) e diminuiu a insulinemia (~79%) sem alterar o conteúdo de glicogênio hepático por até 60 minutos. Além disso, o tratamento com CGRP aumentou a concentração plasmáticas de ácidos graxos livres (~33%) e diminuiu a concentração de glicerol (~50%) e noradrenalina plasmática (~83%). No coração, o tratamento com CGRP aumentou o estado de fosforilação de CREB (Ser133;~3x) e da lipase hormonal sensível (~50%), sugerindo ativação da via de sinalização do AMPc/PKA. O efeito de fosforilação de CREB induzido pelo CGRP coincidiu com uma expressão elevada de SIK1 (~2x), um gene alvo de CREB bem conhecido. Após 15 min, o CGRP aumentou p62 e tendeu a diminuir a razão LC3II:LC3I sugerindo inibição da autofagia. Este efeito foi confirmado em camundongos jejuados, onde o CGRP reduziu o fluxo autofágico cardíaco, conforme estimado pela redução do conteúdo de LC3II (~50%). Em animais alimentados, o tratamento com CGRP também reduziu o estado de fosforilação de Akt, em ambos os resíduos (Thr308 e Ser473; ~60%), não alterou a fosforilação de FoxO1 (Ser256), mas aumentou o estado de fosforilação de mTOR (Ser2448) (~2x), S6 (Ser235/236) (~4x) e Ulk1 (Ser757) (~2x). Além disso, verificou-se aumento transitório da fosforilação de AMPK (Thr172) (~30%) e de Ulk1 (Ser317) (~80%). Em experimentos com cardiomiócitos de ratos neonatos, o CGRP aumentou a fosforilação de CREB e de Akt, após 15 minutos de incubação. A fosforilação de mTOR em resposta ao CGRP in vitro apresentou uma tendência de aumento. Este conjunto de resultados mostra que o tratamento agudo com CGRP induz efeitos diabetogênicos sistêmicos associados a uma rápida inibição do sistema autofágico/liossomal em coração de camundongos. Este efeito antiproteolítico é provavelmente mediado pela via do AMPc/PKA que leva à ativação da mTOR e à fosforilação inibitória em Ulk1, independentemente da sinalização da insulina/Akt.

Calcitonin Gene-Related Peptide (CGRP) is a potent vasodilator peptide widely distributed in the central nervous system and in various peripheral tissues, including skeletal and cardiac muscle. Recent studies from our laboratory have demonstrated that CGRP exerts antiproteolytic effects on the skeletal muscle and in the maintenance of neuromuscular junction in rats. However, its role in controlling the protein metabolism in the heart is still unknown. The main objective of this study was to evaluate the in vivo acute effects of CGRP on cardiac autophagy. For this, male C57B16 mice received a single injection of CGRP (100 ?g/kg subcutaneous) or 0.9% saline and were sacrificed after 15, 30 or 60 minutes. In these periods, metabolites, hormones, cardiac autophagy markers and the state of phosphorylation of proteins related to the control of protein synthesis and degradation were analyzed. The effects of CGRP on autophagic flow were estimated by treatment with colchicine (0.4 mg/kg, intraperitoneal) in mice fed or submitted to 24 hours of fasting (CEUA, 018/2010, FMRP-USP). Blood was collected and hearts were removed for further biochemical, immunoreactivity, immunofluorescence and gene expression analyzes. Catecholamines were quantified by HPLC. The results were expressed as mean±SEM and for statistical analysis the ANOVA test was applied with significance level of 5%. In fed mice, CGRP increased blood glucose (~55%) and decreased insulinemia (~79%) without affecting the hepatic glycogen content for up to 60 minutes. In addition, treatment with CGRP increased plasma concentrations of free fatty acids (~33%) and decreased the concentration of glycerol (~50%) and plasma noradrenaline (~83%). In the heart, CGRP treatment increased the phosphorylation state of CREB (Ser133; ~ 3x) and sensitive hormone lipase (~50%), suggesting activation of the cAMP / PKA signaling pathway. The effect of CGRP-induced CREB phosphorylation coincided with a high expression of SIK1 (~2x), a well-known CREB target gene. After 15 min, CGRP increased p62 and tended to decrease the LC3II: LC3I ratio suggesting inhibition of autophagy. This effect was confirmed in fasted mice, in which CGRP reduced cardiac autophagic flow, as estimated by the reduction of LC3II content (~50%). In fed animals, CGRP treatment also reduced the Akt phosphorylation status in both residues (Thr308 and Ser473; ~60%), did not alter the phosphorylation of Foxo1 (Ser256), but increased the phosphorylation state of mTOR (Ser2448) (~2x) S6 (Ser235 / 236) (~4x) and Ulk1 (Ser757) (~2x). In addition, there was a transient increase in the phosphorylation of AMPK (Thr172) (~30%) and Ulk1 (Ser317) (~80%). In experiments with cardiomyocytes from neonatal rats, CGRP increased CREB and Akt phosphorylation after 15 minutes of incubation. The phosphorylation of mTOR in response to in vitro CGRP showed a tendency to increase. These data show that acute treatment with CGRP induces systemic diabetogenic effects associated with rapid inhibition of the autophagic/lysosomal system in the heart of mice. This antiproteolytic effect is probably mediated by the cAMP cascade leading to mTOR activation and inhibitory phosphorylation in Ulk1, independently of insulin/Akt signaling.