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Dissertação de Mestrado
DOI
10.11606/D.17.2018.tde-28052018-173022
Documento
Autor
Nome completo
Rangel Leal Silva
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
Ribeirão Preto, 2013
Orientador
Banca examinadora
Cunha, Thiago Mattar (Presidente)
Calixto, João Batista
Costa Neto, Claudio Miguel da
Título em português
Mecanismos envolvidos nos efeitos anti-inflamatório e anti-hipernociceptivo da Isobruceina B
Palavras-chave em português
Anti-hipernociceptivo
Anti-inflamatório
Isobruceina B
Macrófagos
NF-kB
Quassinóide
Resumo em português
Objetivo: Avaliar o efeito da Isobruceina B como anti-hipernociceptivo e antiinflamatório, e identificar o mecanismo molecular envolvido. Métodos: Inicialmente, o efeito da IsoB sobre a hipernocicepção inflamatória do tecido plantar foi avaliada por von Frey eletrônico. Os tecidos plantares foram removidos para quantificação indireta da infiltração de neutrófilos por mieloperoxidase (MPO). Seu efeito nocicepção térmica foi avaliado em camundongos pelo teste da placa quente a 55º C. Camundongos pré-tratados com IsoB (s.c.) e tratados com carragenina (i.pl), tiveram seus tecidos plantares removidos para quantificação da liberação de citocinas TNF, IL-1? e KC/CXCL1. Para os estudos in vitro, foram utilizados macrófagos extraídos da cavidade peritoneal de camundongos naïve, pré-tratados com 3% de tioglicolato (i.p.) ou de linhagem RAW 264.7. Macrófagos peritoneais foram incubadas com lipopolissacarídeo (LPS) na presença ou ausência de diferentes concentrações de IsoB, para a quantificação da liberação das citocinas TNF, IL-1?, KC/CXCL1 e IL-10 no sobrenadante pelo método de ELISA. A produção in vitro de óxido nítrico (NO) foi indiretamente determinada pelo método de Griess. Para verificar o efeito da IsoB sobre a via do NF-kB, foram utilizados macrófagos RAW 264.7 estavelmente transfectados com um gene para expressão de luciferase dependente de NF-kB (RAW-Luc), incubados com diferentes estímulos (LPS, peptideoglicano, TNF e acetato de forbol miristato [PMA]) na presença ou ausência de IsoB. A atividade da luciferase foi detectada por meio do Luminômetro. A citotoxicidade da IsoB foi avaliada por MTT, lactato desidrogenase e ensaios de citotoxicidade pelo azul de tripan em macrófagos, in vitro. O efeito da IsoB em macrófagos, sobre a degradação o IkB-? e translocação do NF-kB (pela marcação da subunidade p65) para o núcleo e foram examinados por Western Blot de extratos nucleares e citoplasmáticos, e por Microscopia Confocal. O efeito da IsoB sobre a transcrição do RNAm do gene TNF induzido por LPS, foi avaliada por RT-PCR. Células HEK 293 transfectadas foram utilizadas para verificar o efeito da IsoB sobre a síntese de proteínas. Resultados: A IsoB inibe a hipernocicepção inflamatória, mas não tem efeito sobre a nocicepção térmica. IsoB inibiu a produção/libertação das citocinas IL-1? e KC/CXCL1 in vivo, e de TNF, IL-1?, KC/CXCL1, IL-10 e NO in vitro de forma concentração-dependente. O composto analisado também inibiu a atividade da luciferase, NF-kB dependente, por todos os estímulos testado, de forma concentração-dependente. Não foi detectada atividade citotóxica em nenhuma das concentrações testadas. A IsoB não inibe a degradação do IkB-? ou a translocação de NF-kB para o núcleo. Inesperadamente, o composto natural testado também não reduziu a transcrição de RNAm do gene TNF, porém inibiu a síntese de luciferase inespecificamente induzida. Conclusão: A redução da liberação de citocinas pró- inflamatórias, tais como TNF, IL-1? e KC/CXCL1 e da migração de neutrófilos são mecanismos envolvidos nos efeitos anti-inflamatório e anti-hipernociceptivo da IsoB. Os presentes resultados sugerem um mecanismo molecular baseado na direta inibição da síntese de proteica.
Título em inglês
Mechanisms involved in the anti-inflammatory and antihypernociceptive effects of Isobrucein B
Palavras-chave em inglês
Antihynociceptive
Antiinflammatory
Isobrucein B
Macrophages
NF-kB
Quassinoid
Resumo em inglês
Objective: To evaluate the effect of the Isobruceina B (IsoB) as antihypernociceptive and anti-inflammatory, and identify the molecular mechanism involved. Methods: Initially the effect of IsoB upon inflammatoy hypernociception on plantar tissue was evaluated by electronic von Frey. Plantar tissues were removed for indirect quantification of neutrophil infiltration by myeloperoxidase (MPO). Its effect on thermal nociception in mice was evaluated by the hot plate test at 55 ° C. Mice pretreated with IsoB (s.c.) and treated with carrageenan (i.pl.), their tissues were removed for quantification of plantar release of cytokines TNF, IL-1? and KC/CXCL1. For in vitro studies, macrophages derived from peritoneal cavity of naive mice, pretreated with 3% thioglycolate (i.p.) or line RAW 264.7 were used. Peritoneal macrophages were incubated with lipopolysaccharide (LPS) in the presence or absence of different concentrations of IsoB for the quantification of the release of cytokines TNF, IL-1?, and IL-10 KC/CXCL1 in the supernatant by ELISA. In vitro production of nitric oxide (NO) was indirectly determined by the Griess method. To verify the effect of IsoB on the pathway of NF-kB, RAW 264.7 macrophages stably transfected with a gene to expression NF-kB-dependent luciferase (RAW-Luc) were incubated with different stimuli (LPS, peptidoglycan, TNF and phorbol myristate acetate [PMA]) in the presence or absence of IsoB. The luciferase activity was detected by the Luminometer. The cytotoxicity of IsoB was assessed by the MTT, lactate dehydrogenase and cytotoxicity assays trypan blue on macrophages in vitro. The effect of IsoB on macrophages upon the IkB-? degradation and NF-kB translocation (p65 subunit for marking) to the nucleus were examined by Western blot of nuclear and cytoplasmic extracts, and Confocal Microscopy. The effect of IsoB on the TNF mRNA gene transcription induced by LPS was assessed by RT-PCR. Transfected HEK 293 cells were used to verify the effect of IsoB on the protein synthesis. Results: IsoB inhibits inflammatory hypernociception, but has no effect on thermal nociception. IsoB inhibited the production/release of cytokines IL-1? and KC/CXCL1 in vivo, and TNF, IL-1?, KC/CXCL1, IL-10 and NO in vitro in a concentration-dependent manner. The analyzed compound also inhibited luciferase activity NF-kB-dependent for all stimuli tested in a concentration-dependent manner. Cytotoxic activity was not detected in any of the concentrations tested. The IsoB not inhibit the degradation of IkB-? or translocation of NF-kB to the nucleus. Unexpectedly, the natural compound tested neither reduced transcription of TNF mRNA, but inhibited the synthesis of luciferase induced nonspecifically. Conclusion: The reduction on release of pro-inflammatory cytokines such as TNF, IL-1? and KC/CXCL1 and neutrophil migration are mechanisms involved in anti-inflammatory and anti-hypernociceptive effects of IsoB. The present results suggest a molecular mechanism based on the direct inhibition of protein synthesis.
 
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Rangel.pdf (1.32 Mbytes)
Data de Publicação
2018-07-25
 
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