• JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
 
  Bookmark and Share
 
 
Tese de Doutorado
DOI
10.11606/T.11.2015.tde-29042015-132341
Documento
Autor
Nome completo
Thalita Peixoto Basso
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
Piracicaba, 2015
Orientador
Banca examinadora
Pereira, Gonçalo Amarante Guimarães (Presidente)
Carvalho Netto, Osmar Vaz de
Lopes, Mario Lucio
Gomes, Eleni
Skerker, Jeffrey Michael
Título em inglês
Improvement of Saccharomyces cerevisiae by hybridization for increased tolerance towards inhibitors from second-generation ethanol substrate
Palavras-chave em inglês
adaptive evolution
breeding
inhibitors
lignocellulosic hydrolysate
Saccharomyces cerevisiae
second-generation ethanol
tolerance
Resumo em inglês
Global climate change and volatility of petroleum price have driven the necessity to reduce fossil fuel utilization and replace it by renewable energy. Bioethanol production in the United States and Brazil from cornstarch and sugarcane, respectively, is already established. However, the bioethanol industry appears unsustainable in view of the potential stress that its production places on food commodities. In contrast, second-generation biofuels produced from cheap and abundant lignocellulosic biomass, has been viewed as one plausible solution to this "food versus fuel" problem. Sugarcane bagasse is an abundant source of lignocellulosic biomass in Brazil and is generally recognized as a very promising feedstock for lignocellulosic ethanol production. Nevertheless, inhibitors such as furfural, 5-hydroxymethyl furfural (HMF) and carboxylic acids are formed during an acid thermochemical pretreatment of lignocellulosic biomass, which has a negative effect on the fermentative microorganisms - Saccharomyces cerevisiae. Second-generation (2G) ethanol in Brazil has the possibility to use a novel substrate, prepared as a blend of sugarcane bagasse hydrolysate and cane molasses. Molasses supplements the nutritional deficiencies of bagasse hydrolysate, contributing with minerals, amino acids and vitamins. However, molasses also contains additional inhibitors, such as HMF, sulfite, and toxic concentration of some minerals (K, Ca), which affect S. cerevisiae fermentation performance. The goal of this work was to generate tolerant derivatives of S. cerevisiae industrial strains that are able to cope with inhibitors present in bagasse hydrolysate and molasses, by means of sexual hybridization and adaptive evolution, which can be used for 2G-ethanol production. The industrial strains PE-2, CAT-1 and SA-1 were sporulated, and haploids were irradiated by ultraviolet (UV) light in order to increase genetic and phenotypic diversity. After direct mating and screening in molasses and hydrolysate media, 234 hybrid strains were selected for further study. In parallel, mass matings (intra and interlines) of PE-2, CAT-1 and SA-1 from non-irradiated haploids were performed and the generated strains were subjected to adaptive evolution for about 100 generations. The 120 strains derived from mass mating and adaptive evolution were then screened for growth in molasses-hydrolysate media. Six isolates showed good fermentation properties compared to the reference strains, showing that hybridization and adaptive evolution of Brazilian industrial yeast strains was a good strategy to develop new tolerant strains for 2G-ethanol production. To better utilize all the sugars present in bagasse hydrolysate, a cassette containing the three genes responsible for xylose fermentation (xylose reductase, xylitol dehydrogenase and xylulose kinase) was integrated into the genome of a haploid derivative (272-1a) of one of the six selected hybrids (272), which had the highest tolerance to Miscanthus x giganteus hydrolysate. Fermentation studies demonstrated that this engineered strain was able to metabolize xylose into ethanol. Finally, the haploid 272-1a was analyzed by quantitative trait loci (QTL) mapping to identify the genetic basis of hydrolysate tolerance. Although the causative gene(s) were not identified in this work, a number of QTL peaks were identified that will serve as the starting point for future fine-mapping studies.
Título em português
Obtenção de linhagens de Saccharomyces cerevisiae mediante hibridação para tolerância aos inibidores presentes no hidrolisado de bagaço para produção do etanol de segunda geração
Palavras-chave em português
Saccharomyces cerevisiae
Cruzamentos
Etanol de segunda-geração
Evolução adaptativa
Hidrolisado lignocelulósico
Inibidores
Tolerância
Resumo em português
Mudança climática global e a volatilidade do preço do petróleo tem impulsionado a necessidade de redução e substituição de combustíveis fósseis por energias renováveis. A produção de bioetanol nos Estados Unidos e no Brasil a partir de milho e cana-de-açúcar, respectivamente, está estabelecida. Todavia, a produção de bioetanol mostra-se insustentável, pelo fato da utilização de produtos alimentares para tal produção. Em contrapartida, biocombustíveis produzidos a partir de resíduos lignocelulósicos têm sido vistos como uma solução plausível para o problema "alimento versus combustível". No Brasil, o bagaço de cana é uma fonte disponível de biomassa lignocelulósica. No entanto, inibidores como furfural, 5-hidroximetil-furfural (HMF) e ácidos carboxílicos formados durante o prétratamento ácido da biomassa lignocelulósica, têm efeito negativo sobre os microorganismos fermentadores - Saccharomyces cerevisiae. No Brasil, o etanol de segunda-geração (2G) tem possibilidade de utilizar um novo substrato, preparado a partir da mistura de melaço e hidrolisado de bagaço. O melaço será um adjuvante para suprir a deficiência nutricional do hidrolisado, contribuindo com minerais, aminoácidos e vitaminas. Por outro lado, o melaço apresenta alguns inibidores, como HMF, sulfito, e concentração tóxica de alguns minerais, como potássio (K) e cálcio (Ca), que afetam o crescimento e desempenho fermentativo de S. cerevisiae. O objetivo deste trabalho foi gerar descendentes tolerantes de linhagens industriais de S. cerevisiae, capazes de lidar com inibidores presentes no melaço e no hidrolisado de bagaço, por meio de hibridação e evolução adaptativa, para produção do etanol 2G. As linhagens industriais PE-2, CAT-1 e SA-1 foram esporuladas, seus haplóides foram irradiados por luz ultravioleta (UV), objetivando o aumento da diversidade genética e fenotípica das linhagens. Após cruzamento direcionado, 234 híbridos foram selecionados pelo crescimento (DO570nm) em meios de melaço e hidrolisado. Em paralelo, cruzamentos massais (intra e interlinhagens) de haplóides não-irradiados de PE-2, CAT-1 e SA-1 foram realizados e submetidos a evolução adaptativa por cerca de 100 gerações. As 120 estirpes de cruzamentos massais seguidos de evolução adaptativa foram selecionadas pelo crescimento em meios de melaço e hidrolisado. Seis isolados apresentaram boas características fermentativas em comparação às cepas referências, mostrando que hibridação e evolução adaptativa de linhagens de leveduras industriais brasileiras são boas estratégias para desenvolver novas linhagens para produção do etanol-2G. Para uma melhor utilização dos açúcares do hidrolisado, a cassete contendo os três genes responsáveis pela fermentação de xilose (xilose redutase, xilitol desidrogenase e xiluloquinase) foi integrada no genoma do haplóide segregante (272-1a) de uma das seis estirpes selecionadas (272), que apresentou a maior tolerância em hidrolisado de Miscanthus x giganteus. Estudos de fermentação mostraram que a estirpe foi capaz de metabolizar a xilose em etanol. Por fim, o haploide 272-1a foi analisado por quantitative trait loci (QTL) afim de identificar a base genética da tolerância ao hidrolisado. Apesar, do(s) gene(s) causativos não terem sido identificados nesse trabalho, os picos do mapa de QTL identificados servirão como ponto de partida para futuro mapeamento.
 
AVISO - A consulta a este documento fica condicionada na aceitação das seguintes condições de uso:
Este trabalho é somente para uso privado de atividades de pesquisa e ensino. Não é autorizada sua reprodução para quaisquer fins lucrativos. Esta reserva de direitos abrange a todos os dados do documento bem como seu conteúdo. Na utilização ou citação de partes do documento é obrigatório mencionar nome da pessoa autora do trabalho.
Data de Publicação
2015-05-08
 
AVISO: Saiba o que são os trabalhos decorrentes clicando aqui.
Todos os direitos da tese/dissertação são de seus autores
Centro de Informática de São Carlos
Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP. Copyright © 2001-2018. Todos os direitos reservados.