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Tese de Doutorado
DOI
10.11606/T.11.2015.tde-28042015-143631
Documento
Autor
Nome completo
Juliana Ramiro
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
Piracicaba, 2015
Orientador
Banca examinadora
Massola Júnior, Nelson Sidnei (Presidente)
Caldas, Danielle Gregorio Gomes
Gasparoto, Maria Cândida de Godoy
Machado, José da Cruz
Moraes, Maria Heloisa Duarte de
Título em português
Detecção molecular de fungos fitopatogênicos associados às sementes de soja
Palavras-chave em português
Glycine max
Diagnose
Fitopatógenos
qPCR
Resumo em português
Fungos fitopatogênicos veiculados por sementes de soja podem causar sérios prejuízos à cultura, bem como danos diretos reduzindo o poder germinativo, vigor e emergência das sementes. A detecção e identificação precisa de fitopatógenos é uma das estratégias mais importantes para iniciar as medidas preventivas ou curativas no controle de doenças de plantas. Para se evitar a introdução e propagação de patógenos em áreas onde ainda não ocorrem, uma atenção especial deve ser tomada na detecção de agentes patogênicos em sementes. Os métodos tradicionalmente utilizados para detectar e identificar fungos em sementes são, muitas vezes, demorados, laboriosos e exigem um conhecimento extenso de taxonomia clássica. Métodos moleculares têm sido utilizados para detectar, identificar e quantificar uma longa lista de fungos fitopatogênicos. A técnica da reação em cadeia da polimerase em tempo real (qPCR) é atualmente considerada a mais eficiente para a detecção de fitopatógenos, não exigindo conhecimentos taxonômicos especializados para interpretar seus resultados. Considerando a importância e as implicações da diagnose rápida e bem sucedida de agentes patogênicos em sementes de soja, este estudo teve como objetivo estabelecer uma metodologia para elevar a eficiência de detecção dos fungos fitopatogênicos Sclerotinia sclerotiorum, Colletotrichum truncatum, Phomopsis spp. e Corynespora cassiicola, encontrados com maior frequência em sementes de soja, por meio de qPCR. Iniciadores e sondas de hidrólise TaqMan® foram projetados para os diferentes patógenos e avaliados quanto à sua especificidade e sensibilidade. Curvas padrões, baseando-se em diluições seriadas dos DNAs alvos de iniciadores e sondas específicas, foram estabelecidas para a quantificação desses patógenos. Amostras de sementes de soja naturalmente infectadas, provenientes dos Estados de Goiás, Minas Gerais e Paraná, foram submetidas a testes de detecção por meio de qPCR e métodos tradicionais, para fins de comparação. De todos os iniciadores e sondas projetados, apenas os de Phomopsis spp. e S. sclerotiorum apresentaram-se específicos e sensíveis, viabilizando sua utilização na detecção desses patógenos. Por meio dos testes tradicionais de detecção, Phomopsis spp. apresentou incidência máxima de 2,75% em uma amostra de Minas Gerais e S. sclerotiorum não foi detectado em nenhuma das amostras avaliadas. O método de qPCR proporcionou a detecção de Phomopsis spp. em todas as amostras testadas, alcançando o nível de incidência máximo de 6,75%. em amostra de Minas Gerais. S. sclerotiorum não foi detectado em nenhuma das amostras avaliadas pelo método de qPCR. Comparando-se os métodos de detecção testados, a qPCR foi mais sensível na detecção de Phomopsis spp. em sementes de soja.
Título em inglês
Molecular detection of seed-born pathogenic fungi in soybean
Palavras-chave em inglês
Glycine max
Diagnosis
Plant pathogens
qPCR
Resumo em inglês
Seed-born pathogenic fungi in soybean can cause serious damage to the crop, as well as direct damage by reducing seeds germination, vigor and emergence. The detection and accurate identification of plant pathogens is one of the most important strategies to initiate preventive and curative measures in the management of plant diseases. Particular attention should be taken in the detection of pathogens in seeds in order to avoid introduction and spread of pathogens in areas where they do not occur. The traditionally used methods for detection and identification of seed-born pathogenic fungi are often time consuming, laborious and require extensive knowledge of classical taxonomy. Molecular methods have been used to detect, identify and quantify a long list of plant pathogenic fungi. Quantitative real time polymerase chain reaction (qPCR) is currently considered the most efficient technique for the detection of pathogens because it does not require specialized taxonomical knowledge to interpret its results. Given the importance and implications of rapid and successful diagnosis of seed-born pathogenic fungi in soybean, this study aimed to establish a qPCR methodology to increase the detection efficiency of plant pathogenic fungi Sclerotinia sclerotiorum, Colletotrichum truncatum, Phomopsis spp. and Corynespora cassiicola, the most commonly occurring seed-born pathogenic fungi. Primers and TaqMan® hydrolysis probes were designed for these four pathogens and tested for specificity and sensitivity. Standard curves were established to quantify these pathogens, based on serial dilutions of the target DNA and specific primers and probes. Samples of naturally infected soybean seed from the states of Goiás, Minas Gerais and Paraná were subjected to detection tests using qPCR and traditional methods, for comparison purposes. From all primers and probes designed, only those for Phomopsis spp. and S. sclerotiorum showed up specificity and sensitivity, enabling their use to detect of these pathogens. Detection by traditional tests, resulted in a maximum Phomopsis spp. incidence of 2.75% in a sample from Minas Gerais and S. sclerotiorum was not detected in any of the samples. The detection and quantification of these pathogens by qPCR revealed the presence of Phomopsis spp. in all tested samples, the highest incidence level of 6.75% in a sample from Minas Gerais. S. sclerotiorum was not detected in any sample assessed by qPCR method. In comparison with traditional methods, qPCR was more sensitive in detecting Phomopsis spp. in soybean seeds.
 
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Data de Publicação
2015-05-06
 
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