• JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
 
  Bookmark and Share
 
 
Tese de Doutorado
DOI
10.11606/T.10.2018.tde-09042018-095628
Documento
Autor
Nome completo
Larissa do Rêgo Barros Matos
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Paulo, 2017
Orientador
Banca examinadora
Aniz, Patricia Antonia Estima Abreu de (Presidente)
Azevedo, Anita Mitico Tanaka
Franzolin, Marcia Regina
Gregori, Fabio
Lima, Roberto Nepomuceno de Souza
Título em português
Caracterização de proteínas secretadas por Leptospira spp. e sua possível aplicação no diagnóstico da leptospirose
Palavras-chave em português
Brevibacillus
Leptospirose
Lipase
Proteínas secretadas
Sistemas de expressão heteróloga
Resumo em português
A leptospirose é causada por bactérias do gênero Leptospira e constitui um problema de saúde pública mundial, por acometer humanos e animais. Sua patogênese ainda é pouco esclarecida, especialmente quanto aos processos de invasão, adesão e colonização dos hospedeiros. Recentemente, proteínas secretadas por leptospiras foram identificadas por proteômica e análises in silico, algumas das quais apresentam possível envolvimento no desenvolvimento de quadros hemorrágicos, bem como podem ser possíveis antígenos para diagnóstico. Sendo assim, o presente trabalho propôs a clonagem em vetor de expressão heteróloga bacteriano das sequências codificantes das proteínas Sph2, LipA, ColA e LipL32 de L. interrogans sorovar Copenhageni, caracterização funcional das proteínas recombinantes purificadas e estudo do seu potencial uso no diagnóstico para a leptospirose. Essas proteínas foram escolhidas por possivelmente estarem envolvidas na patogênese de leptospiras. Para tanto, as sequências correspondentes aos genes das proteínas foram clonadas nos vetores de expressão em Brevibacillus choshinensis e Escherichia coli. A produção de soro policlonal e técnicas de ELISA, western-blotting e imuno-histoquímica foram realizadas para avaliar a funcionalidade das proteínas recombinantes purificadas. Também foram realizados testes de comprovação e caracterização da atividade enzimática para proteína LipA, que se apresenta como uma provável lipase na análise in silico. Os resultados obtidos mostraram que o sistema de expressão em Brevibacillus foi eficiente na expressão das proteínas, porém com baixo rendimento na purificação das proteínas Sph2, ColA e LipA. A proteína recombinante LipL32 purificada não apresentou diferença na sua atividade antigênica, em relação aos dois sistemas de expressão utilizados. Experimentos de Western - blotting demonstraram a presença de proteína LipA em diferentes sorovares patogênicos de Leptospira spp. A proteína LipA apresentou atividade lipásica sobre ésteres graxos de p-nitrofenil, sendo uma provável lipase euritérmica. Os dados obtidos com a análise de imuno-histoquímica sugerem que esta proteína possa participar dos eventos que levam a lesões na membrana celular no tecido hepático. Resultados de ELISA com soro de pacientes mostraram que as proteínas ColA e Sph2 são potenciais antígenos para diagnóstico da leptospirose. Apenas a proteína ColA apresentou ação hemorrágica na pele de camundongos. Estes resultados indicam que as proteínas LipA, ColA e Sph2 podem estar envolvidas em mecanismos patogênicos na leptospirose.
Título em inglês
Characterization of secreted proteins by Leptospira spp. and its possible application in the diagnosis of leptospirosis
Palavras-chave em inglês
Brevibacillus
Heterologous expression systems
Leptospirosis
Lipase
Secreted proteins
Resumo em inglês
Leptospirosis is caused by bacteria of the genus Leptospira and it is a public health problem worldwide, for affecting humans and animals. Its pathogenesis is still unclear, especially regarding the processes of invasion, adhesion and colonization of hosts. Recently, proteins secreted by leptospires were identified by proteomics and in silico analyzes, some of which present possible involvement in the development of hemorrhagic conditions, as well they could be possible antigens for the diagnosis. Thus, the present work proposed the cloning into bacterial heterologous expression vectors of the coding sequences of the Sph2, LipA, ColA and LipL32 proteins of L. interrogans serovar Copenhageni, the functional characterization of the purified recombinant proteins and the study of their potential use in the diagnosis for the Leptospirosis. These proteins were chosen because they may be involved in the pathogenesis of leptospires. To that end, the coding sequences were cloned into the expression vectors in Brevibacillus choshinensis and Escherichia coli. The production of polyclonal serum and ELISA, Western-blotting and immunohistochemistry techniques were performed to evaluate the functionality of the purified recombinant proteins. Also, tests were carried out to prove and characterize the enzymatic activity of LipA protein, which presents as a probable lipase in the in silico analysis. The obtained results showed that the expression in the Brevibacillus system was efficient, but with low yield in the purification of Sph2, ColA and LipA proteins. The purified recombinant LipL32 protein showed no difference in its antigenic activity, in relation to the two expression systems used. Western-blotting experiments demonstrated the presence of LipA protein in different pathogenic serovars of Leptospira spp. The LipA protein showed lipase activity on p-nitrophenyl fatty esters, being a probable eurythermic lipase. The data obtained with the immunohistochemical analysis suggest that this protein can participate in the events that lead to cell membrane lesions in the hepatic tissue. ELISA results using serum from patients showed that ColA and Sph2 proteins are potential antigens for the diagnosis of leptospirosis. Only the ColA protein presented hemorrhagic action on the mice skin. These results indicate that LipA, ColA and Sph2 proteins may be involved in pathogenic mechanisms in leptospirosis.
 
AVISO - A consulta a este documento fica condicionada na aceitação das seguintes condições de uso:
Este trabalho é somente para uso privado de atividades de pesquisa e ensino. Não é autorizada sua reprodução para quaisquer fins lucrativos. Esta reserva de direitos abrange a todos os dados do documento bem como seu conteúdo. Na utilização ou citação de partes do documento é obrigatório mencionar nome da pessoa autora do trabalho.
Data de Publicação
2018-07-25
 
AVISO: Saiba o que são os trabalhos decorrentes clicando aqui.
Todos os direitos da tese/dissertação são de seus autores
CeTI-SC/STI
Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP. Copyright © 2001-2019. Todos os direitos reservados.