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Tese de Doutorado
DOI
10.11606/T.10.2008.tde-09012009-162214
Documento
Autor
Nome completo
Alessandra Cunha Brandão
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Paulo, 2008
Orientador
Banca examinadora
Assumpção, Mayra Elena Ortiz D'Avila (Presidente)
Arruda, Rubens Paes de
Celeghini, Eneiva Carla Carvalho
Lopes, Fabíola Freitas de Paula
Milazzotto, Marcella Pécora
Título em português
Efeito do laser diodo sobre as características de motilidade, de integridade das membranas plasmática e acrossomal e de potencial de membrana mitocondial de espermatozóides criopreservados de eqüinos
Palavras-chave em português
Citometria de fluxo
Criopreservação do sêmen
Garanhão
Laser de baixa intensidade
Viabilidade espermática
Resumo em português
A motilidade espermática depende do consumo de energia. Em algumas espécies, a mitocôndria espermática tem um importante papel na produção de energia para o batimento flagelar. A irradiação com Laser de baixa intensidade aumenta a produção de energia funcionando como uma ferramenta de biomodulação. O objetivo deste estudo foi analisar o efeito da irradiação contínua de 650 nm de comprimento de onda de Laser Diodo, com dose de 6 J/cm2 por 120s, na motilidade, integridade das membranas plasmática e acrossomal e no potencial de membrana mitocondrial em espermatozóides in natura e criopreservados. Cinco ejaculados foram obtidos de cinco garanhões (n=25). O sêmen foi acondicionado em palhetas de 0,5mL com 200x106 cells/mL em diluidor Botu-CrioTM (Biotech-Botucatu-Ltda/ME, Botucatu, Brasil) e congelado utilizando o sistema automático programável (TK3000®, TK Tecnologia em Congelação_Ltda, Uberaba, Brasil). As amostras in natura foram divididas em dois grupos: espermatozóides tratados COM LASER e espermatozóides não tratados - SEM LASER. As amostras congeladas foram divididas em três grupos: espermatozóides tratados COM LASER antes da congelação; espermatozóides tratados COM LASER depois da congelação e espermatozóides criopreservados não tratados SEM LASER. As amostras criopreservadas foram analisadas imediatamente após a descongelação (tempo zero) e duas horas após a descongelação (tempo 2). A motilidade foi avaliada pelo sistema de análise espermática computadorizada (CASA, Ivos-Ultimate of Hamilton Thorne Biosciences), a integridade das membranas plasmática e acrossomal e o potencial de membrana mitocondrial foram avaliados pela técnica de citometria de fluxo (FACSaria-Beckton-Dickeson, San Jose, USA). Os dados foram analisados pelo programa SAS, com nível de significância de 5%. A freqüência de batimentos flagelar (BCF) foi alta (P<0,05) para o grupo de espermatozóides in natura tratados COM LASER (34,8 ± 0,7%) quando comparado com o grupo de espermatozóides in natura não tratados SEM LASER (33,4 ± 0,8%). No tempo zero, o potencial de membrana mitocondrial foi baixo no grupo de espermatozóides tratados COM LASER antes da congelação (40,7 ± 1,5%) quando comparados com o grupo de espermatozóides congelados não tratados - SEM LASER (47,4 ± 2,4%) (P<0,05). Duas horas após a descongelação, as membranas plasmática e acrossomal apresentavam maior porcentagem de integridade no grupo de espermatozóides tratados COM LASER antes da congelação (8,3 ± 0,7%) do que no grupo congelado não tratados - SEM LASER (6,2 ± 0,6%) (P<0,05). O grupo de espermatozóides tratados COM LASER depois da congelação não diferiu (P>0,05) dos outros grupos do tempo 2, porém no tempo zero a porcentagem de espermatozóides com motilidade progressiva foi baixa (2,0 ± 0,3%) e diferente (P<0,05) dos outros grupos (6,5 ± 1,3 nos espermatozóides tratados COM LASER antes da congelação e 5,5 ± 1,1% nos espermatozóides congelados não tratados - SEM LASER). Estes resultados indicam que a irradiação de 650 nm de comprimento de onda aumenta a freqüência de batimentos flagelar no sêmen fresco e confere melhor proteção à membrana plasmática e acrossomal ao longo do tempo (após 2h de incubação). Os resultados com sêmen congelado permitem concluir que o melhor momento para a aplicação do laser é antes da criopreservação. Novos estudos com diferentes comprimentos de onda, potência do raio e dosagem devem ser conduzidos para se obter um melhor protocolo visando aprimorar a criopreservação do sêmen eqüino.
Título em inglês
Effect of diode laser on motility, plasma and acrosomal membrane integrity, and mitochondrial membrane potential of cryopreserved stallion spermatozoa
Palavras-chave em inglês
Flow cytometry
Low level laser
Semen cryopreservation
Sperm viability
Stallion
Resumo em inglês
Sperm motility depends on energy consumption. In some species sperm mitochondria play an important role in the production of energy for tail activity. Low-level laser irradiation increases this production as a modulation tool. The objective of this study was to analyze the effect of a continuous 650 nm wavelength diode laser irradiation, with dose 6 J/cm2 for 120s, in the motility, plasma and acrosomal membrane integrity and mitochondrial membrane potential in fresh and frozen equine spermatozoa. Five ejaculates were obtained from five stallions (n=25). Semen was packaged into 0.5mL straws with 200x106 cells/mL in a Botu-CrioTM (Biotech-Botucatu-Ltda/ME, Botucatu, Brazil) and frozen by automated technique using a programmed machine (TK3000®, TK Tecnologia em Congelação-Ltda, Uberaba, Brazil). Fresh samples were divided in two groups: spermatozoa treated with laser and without laser (non treated spermatozoa), and frozen samples in three groups: spermatozoa treated with laser before freezing; spermatozoa treated with laser after thawing and without laser (cryopreserved spermatozoa). Cryopreserved samples were analyzed immediately after thawing (time 0) and two hours after thawing (time 2). Motility was evaluated by computer assisted sperm analysis (CASA, Ivos-Ultimate of Hamilton Thorne Biosciences), plasma and acrosomal membrane integrity and mitochondrial membrane potential were evaluated by flow cytometry (FACSaria-Beckton-Dickeson, San Jose, USA). The data were analyzed by the SAS program, at a 5% level. Beat cross frequency (BCF) test was higher (p<0.05) for fresh semen group treated with laser (34.8 ± 0.7%) as compared to non treated group (without Laser - 33.4 ± 0.8%). At time zero, mitochondrial membrane potential was lower in laser treatment before freezing group (40.7 ± 1.5%); compared to without laser treatment group (cryopreserved spermatozoa - 47.4 ± 2.4%) (P<0.05). Two hours after thawing, plasma and acrosomal integrity was higher (P<0.05) in the group were spermatozoa were treated with laser before freezing (8.3 ± 0.7%) compared with the group without laser treatment (cryopreserved spermatozoa) (6.2 ± 0.6%). The group treated with laser after thawing didn´t show any difference (P>0.05) compared to the others groups at this period. However, at time 0 percentage of progressive motility was lower (2.0 ± 0.3%) (P<0.05) than groups treated with laser before freezing (6.5 ± 1.3%) and cryopreserved without laser (5.5 ± 1.1%). These results indicated that the irradiation of 650 nm wavelength diode laser improves beat cross frequency in the fresh semen and support a long term (2 hours) protection to plasma and acrosomal membrane of equine spermatozoa. Based on the results of frozen semen, the best moment for laser application is before cryopreservation protocol. New studies with different diode laser wavelength, different power and energy doses should be driven in order to improve stallion semen cryopreservation.
 
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Data de Publicação
2009-02-04
 
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