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Tese de Livre Docencia
DOI
10.11606/T.46.2013.tde-20092013-151245
Documento
Autor
Nome completo
Walter Ribeiro Terra
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Paulo, 1977
Banca examinadora
Fernandes, Jose Ferreira (Presidente)
Colli, Walter
Gazzinelli, Giovanni
Giglio, Jose Roberto
Migliorini, Renato Helios
Título em português
Bioquímica da digestão e estudos cinéticos da amilase e trealase intestinais de Rhynchosciara americana
Palavras-chave em português
Amilase
Bioquímica
Digestão animal
Digestão de insetos
Diptera
Enzimas
Intestino de animal
Trealase
Resumo em português
Os ensaios quantitativos de grande número de enzimas em diferentes segmentos do tubo digestivo da larva de Rhynchosciara americana, mostraram que o processo digestivo ocorre no intestino médio, e permitiram propor a existência de tres fases espacialmente organizadas naquele processo. A primeira fase ocorreria no interior da membrana peritrófica e consistiria no ataque às ligações internas de polímeros, resultando em oligômeros que se difundiriam para fora da membrana peritrófica. A segunda fase da digestão consistiria na hidrólise dos oligômeros nos espaços luminais exteriores à membrana peritrófica, que incluem o lúmen dos cecos. Se o oligômero for derivado de um homopolímero (amido ou celulose) ele será hidrolizado pelos mesmos tipos de enzima presentes no interior da membrana peritrófica, enquanto se for originado de um heteropolímero (proteína), as enzimas serão diferentes. Finalmente, a terceira fase da digestão ocorre nas células epiteliais dos cecos e, em menor proporção, nas células epiteliais do ventrículo posterior. A existência de dois sítios extracelulares para a digestão de R. americana é considerada como uma adaptação para poupar enzimas digestivas, pois somente aquelas que penetrarem na membrana peritrófica serão perdidas rapidamente. A amilase e a trealase presentes no tubo digestivo de R. americana foram escolhidas, devido sua elevada atividade, para estudos mais detalhados. A amilase de R. americana liga cloreto (KD = 1,6 mM a 37° C) resultando em um aumento de 34 vezes no Kcat sem afetar o Km, mas deslocando o pH ótimo da enzima de 6,8 para 8,0. Os íons Br-, NO3-; e I- também ativam a enzima mas com eficiência decrescente. Um plote de Arrhenius de atividade em função da temperatura mostra que a amilase apresenta apenas uma inclinação com uma energia de ativação aparente de 4,8 K cal/mol. A amilase parece ser uma metaloenzima que mostra uma inibição competitiva linear simples para Hg++ e uma inibição não competitiva linear simples para Cu++ com Ki respectivamente de 0,21 mM e 0,23 mM. A resistência aos reagentes sulfidrílicos p-mercuriobenzoato e iodoacetato juntos com o alto Ki para Hg++ sugerem que grupos sulfidrilas não são essenciais para a atividade da amilase intestinal. Curvas de valores azul em função de valores de redução mostraram que a amilase intestinal é uma α-amilase (EC 3.2.1.1) com um grau de ataque múltiplo entre 1,7 e 6. Eletroforese em gel de poliacrilamida de homogeneizados de intestino médio mostraram a existência de duas amilases principais, uma das quais predomina por larga margem. Os resultados são comparados com α-amilases de várias fontes. A trealase (EC 3.2.1.28) intestinal de R. americana é solúvel, tem um peso molecular de 1,22x105 daltons e um pI de 4,6. O pH ótimo da enzima é 6,0, seu Km aparente para trealose é 0,67 mM e sua energia de ativação é 16,7 Kcal/mol. Reagentes sulfidrílicos não inibem a trealase. Um estudo do efeito do pH sobre o Vmax e Vmax/Km a diferentes temperaturas permitiu determinar os pKs dos grupos prototrópicos essenciais presentes na enzima e estimar ΔGoion, ΔHoion e ΔSoion. Os resultados sugerem a existência de dois grupos carboxila no sítio ativo, um dos quais tem um pK muito alto (8, 3). O aumento dos pKs dos grupos essenciais da enzima livre na presença de concentrações crescentes de dioxana suporta a hipótese de que aqueles grupos sejam carboxilas. A enzima purificada por eletroforese em gel de poliacrilamida hidroliza somente α,α'-trealose e é competitivamente inibida por vários compostos dos quais destacam-se sacarose e p-nitrofenil-β-D-glicosídeo. Tris e dioxana são, inibidores competitivos fracos que se ligam a dois sítios diferentes no centro ativo da trealase, embora um pouco interpenetrados.
Título em inglês
Biochemistry of digestion and kinetic studies on midgut amylase and trehalase from Rhynchosciara americana
Palavras-chave em inglês
Amilase
Animal digestion
Biochemistry
Diptera
Enzymes
Insect digestion
Trehalase
Resumo em inglês
The quantitative assay of several enzymes in different sections of the Rhynchosciara americana larval gut showed the digestion occurs only in the midgut, and it gave support to the proposition that digestion takes place in three spatially organized steps. The first one occurs inside the peritrophic membrane and consists of an attack to the internal bonds of polymers, resulting in oligomers which diffuse out the peritrophic membrane. The second step in digestion is the hydrolysis of oligomers in the luminal spaces outside the peritrophic membrane, which include the lumina of the caeca. if the oligomer comes from a homopolymer (starch or cellulose) it will be hydrolyzed by the same kind of enzymes present inside the peritrophic membrane, while if it is derived from a heteropolymer (protein), the enzymes will be different. Finally, the third step in digestion occurs at the epithelial cells of caeca and, ,in a less extent, in the epithelial cells of the posterior ventriculus. The existence of two extracellular sites for digestion in R. americana is supposed to be an adaptation to conserve digestive enzymes, since only those which pass into the peritrophic membrane will be lost quickly. The R.americana midgut amylase and trehalase, due to their high activity, have been choosen as the subjects of more detailed studies. R. americana midgut amylase binds chloride (KD =1.6 mM at 37°C) resulting in a 34-fold increase in the Kcat without affecting the Km, but causing a shift in the optimum pH of the enzyme from 6.8 to 8.0. The ions Br-, NO3-, and I- also activate the amylase but with a decreasing efficiency. An Arrhenius plot of activity versus temperature show that the amylase display only one slope with a corresponding apparent energy of activation of 4.8 Kcal/mole. The amylase seems to be a metalloenzyme which shows a simple linear competitive inhibition by Hg++ and a simple linear non-competitive inhibition by Cu++ with Ki respectively of 0.21 mM and 0.23 mM. The resistance to the sulfhydryl reagents p-mercuribenzoate and iodoacetate together with the high Hg++ Ki suggest that sulfhydryl groups are not essential for the midgut amylase activity. Curves of blue-reducing values showed the midgut amylase is an α-amy1ase (EC 3.2.1.1) with a multiple attack degree between 1.7 and 6. Polyacrylamide gel electrophoresis of midgut homogenates shows the existence of two major isoamylases one of which is largely predominant. The results are compared with α-amylases from several sources. The R.americana midgut trehalase (EC 3.2.1.28) is soluble and have a molecular weight of 1.22 x 105 daltons and a pI 4.6. The optimum pH of the enzyme is 6.0, its apparent Km for trehalose is 0.67 mM and its energy of activation is 16.7 K cal/mole. Sulfhydryl reagents do not inhibit the trehalase. A study of the effect of pH on Vmax and Vmax/Km at different temperatures make it possible to determinative the pKs of the essential prototropic groups present in the enzyme and to estimate ΔGoion, ΔHoion and ΔSoion. The results suggest the existence of two carboxyl groups in the active site, one of which have a very high (8.3) pK. The increase of the pKs, of the essential groups of the free enzyme in the presence of increasing concentrations of dioxane supports the hypothesis those groups are carboxyls. The enzyme purified by polyacrylamide gel electrophoresis hydrolyzes only α,α'-trehalose and it is competitively inhibited by several compounds from which sucrose and p-nitrophenyl-β-D-glucoside are strong and Tris and dioxane are weak inhibitors. The latter inhibitors bind at two different, although a little interpenetrated sites in the active center of trehalase.
 
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Data de Publicação
2013-09-26
 
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