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Thèse de Doctorat
DOI
https://doi.org/10.11606/T.99.2020.tde-28022020-112745
Document
Auteur
Nom complet
Mahyumi Fujimori
Adresse Mail
Unité de l'USP
Domain de Connaissance
Date de Soutenance
Editeur
São Paulo, 2019
Directeur
Jury
Goto, Hiro (Président)
Hiramoto, Roberto Mitsuyoshi
Kanunfre, Kelly Aparecida
Laurenti, Marcia Dalastra
Titre en portugais
Validação de ensaio imunoenzimático (ELISA) com antígenos recombinantes no diagnóstico sorológico da infecção canina por Leishmania infantum
Mots-clés en portugais
ANTÍGENOS
CÃES
DIAGNÓSTICO
ELISA
INQUÉRITOS EPIDEMIOLÓGICOS
LEISHMANIOSE VISCERAL
Resumé en portugais
O cão é o principal reservatório peridomiciliar de Leishmania (Leishmania) infantum, agente etiológico da leishmaniose visceral (LV). Em áreas endêmicas para LV, a identificação e eutanásia de cães infectados são considerados cruciais no controle da transmissão de L. (L.) infantum para humanos. Atualmente, o algoritmo recomendado pelo Ministério da Saúde do Brasil consiste em triagem de cães pelo ensaio imunocromatográfico TR DPP® Leishmaniose Visceral Canina (DPP) e confirmação de casos positivos por ELISA usando antígeno de lisado total de Leishmania major-like (ELISA-L. major-like). Como a cultura de parasitos para preparo deste kit de ELISA constitui um fator limitante, o uso de antígeno recombinante (r) aparece como uma alternativa atraente. Neste estudo, avaliou-se o ensaio ELISA com os antígenos rK39, rK28, rKR95 e rK18 (IDRI, EUA) derivados de Leishmania. Empregando soros de 74 cães de áreas endêmicas para LV canina (CVL), com exame parasitológico positivo e de 66 cães saudáveis (negativos para DPP, ELISA L. major-like e DAT), coletados em uma cidade sem registro de LVC, a sensibilidade do ELISA-rK39, -rK28, -rK18 foi, respectivamente, 97%; 96%; 96% e 89% e a especificidade, 100%; 100%; 100% e 99%. Placas sensibilizadas com cada um dos antígenos mantiveram a estabilidade por até 180 dias, quando armazenadas a 4ºC e -20ºC. A avaliação da repetitividade e reprodutibilidade apresentou coeficientes de variação compatíveis com os valores aceitáveis. Para a validação do ELISA com os diferentes antígenos recombinantes, avaliaram-se 2.530 amostras de inquéritos epidemiológicos de estados endêmicos para LVC no Brasil: Pará, Mato Grosso, São Paulo e Bahia. A positividade com DPP combinada com ELISA-L. major-like foi 16% e do DPP combinado com ELISA-rK39 foi 17%, sugerindo a possibilidade de substituir o ELISA-L. major-like por ELISA baseado em antígeno recombinante. No entanto, quando ensaiadas diretamente sem triagem com DPP, a positividade do ELISA- rK39, rK28 e rKR95 foi cerca de 10% mais elevada do que com ensaios correntes em uso, respectivamente, 28%; 27% e 27%, sugerindo a detecção precoce de animais infectados. Para responder a essa hipótese, analisaram-se 15 cães (pertencentes a uma coorte de 600 cães de Bauru-SP) que pelo algoritmo recomendado pelo Ministério da Saúde do Brasil, na primeira intervenção, haviam sido considerados negativos para infecção por Leishmania e, que 6 meses após a avaliação inicial eram positivos. Nas amostras supostamente negativas na avaliação inicial, os testes ELISA-rK39, -rK28 e -rKR95 apresentaram, respectivamente, 67%, 80% e 60% de positividade. Esses dados sugerem uma quantidade significativa de resultados falso-negativos no algoritmo em uso. A viabilidade da aplicação deste ELISA baseado em antígeno recombinante em áreas endêmicas para LVC também foi avaliada e obteve-se concordância variando de boa a perfeita, entre os resultados obtidos em todos os laboratórios envolvidos e os do laboratório de coordenação. Com a análise global deste estudo, principalmente levando em conta a variabilidade da resposta em certas áreas do Brasil, consideramos validado o ELISA-rK39 para diagnóstico da infecção canina por L. infantum. Os dados apontam ainda para a necessidade de reavaliar os ensaios e o algoritmo na utilização de rotina para a detecção de cães infectados com L. infantum.
Titre en anglais
Validation of immunoenzymatic assay (ELISA) with recombinant antigens in the serological diagnosis of canine infection by Leishmania infantum
Mots-clés en anglais
ANTIGENS
DIAGNOSIS
DOGS
ELISA
EPIDEMIOLOGICAL SURVEYS
VISCERAL LEISHMANIOSIS
Resumé en anglais
The dog is the main peridomiciliar reservoir of Leishmania (Leishmania) infantum, etiologic agent of visceral leishmaniasis (VL). In areas endemic for VL, the identification and euthanasia of infected dogs are considered crucial in controlling transmission of L. infantum to humans. Currently, the algorithm recommended by the Brazilian Ministry of Health consists in screening of dogs by the immunochromatographic test TR DPP® Leishmaniose Visceral Canina (DPP) and confirmation of positive cases by ELISA using lysate antigen of Leishmania major-like (ELISA-L. major-like). As parasite culture for the preparation of this ELISA kit is a limiting factor, the use of recombinant antigen (r) appears as an attractive alternative. In this study, the ELISA with the rK39, rK28, rKR95 and rK18 antigens (IDRI, USA) derived from Leishmania was evaluated. Using sera from 74 dogs from endemic areas for canine LV (CVL), with positive parasitological examination and 66 healthy dogs (DPP negative, ELISA L. major-like and DAT), collected in a city without LVC registry, the sensitivity of the ELISA-rK39, -rK28, -rK18 was, respectively, 97%; 96%; 96% and 89% and the specificity, 100%; 100%; 100% and 99%. Plates sensitized with each antigen maintained stability for up to 180 days when stored at 4°C and -20° C. The evaluation of repeatability and reproducibility presented coefficients of variation compatible with acceptable values. For the validation of the ELISA with the different recombinant antigens, 2,530 samples from epidemiological surveys of CVL endemic states in Brazil: Pará, Mato Grosso, São Paulo and Bahia were evaluated. Positivity with DPP combined with ELISA-L. major-like was 16% and the DPP combined with rK39 ELISA was 17%, suggesting the possibility of replacing the ELISA-L. major-like ELISA based on recombinant antigen. However, when assayed directly without DPP screening, the positivity of ELISA-rK39, rK28 and rKR95 was about 10% higher than with current assays in use, respectively, 28%; 27% and 27%, suggesting the early detection of infected animals. To answer this hypothesis, we analyzed 15 dogs (from a cohort of 600 dogs from Bauru-SP) that, according to the algorithm recommended by the Brazilian Ministry of Health, in the first intervention, had been considered negative for Leishmania infection and, 6 months after the initial evaluation were positive. In the samples that were supposedly negative in the initial evaluation, the ELISA-rK39, -rK28 and -rKR95 tests presented, respectively, 67%, 80% and 60% of positivity. These data suggest a significant amount of false negative results in the algorithm in use. The viability of the application of this ELISA based on recombinant antigen in areas endemic to CVL was also evaluated and agreement was obtained ranging from good to perfect, between the results obtained in all laboratories involved and those in the coordination laboratory. With the global analysis of this study, mainly considering the variability of the response in certain areas of Brazil, we consider the validation of the ELISA-rK39 for the diagnosis of canine infection by L. infantum. The data also point out the need to reassess the tests and the algorithm in routine use for the detection of dogs infected with L. infantum.
 
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Date de Libération
2022-02-27
Date de Publication
2020-02-28
 
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