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Master's Dissertation
DOI
10.11606/D.99.2013.tde-22042014-092904
Document
Author
Full name
Thaynan Fernandes Cunha Martins
E-mail
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
São Paulo, 2013
Supervisor
Committee
Cotrim, Paulo Cesar (President)
Chioccola, Vera Lucia Pereira
Laurenti, Marcia Dalastra
Title in Portuguese
Análise da eficiência da PCR com identificação específica do agente etiológico para o diagnóstico da Leishmaniose Visceral Canina
Keywords in Portuguese
Amostras clínicas
kDNA
Leishmania
Leishmaniose visceral animal
Reação de cadeia por polimerase
Técnicas de diagnóstico molecular
Abstract in Portuguese
Atualmente, um dos grandes problemas relacionados à leishmaniose é a falta de um diagnóstico específico capaz de indentificar e diferenciar espécies de Leishmania com rapidez e precisão. O desenvolvimento de métodos moleculares como a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), possibilita que o diagnóstico da Leishmaniose Visceral Canina (LVC) possa se tornar mais preciso e, eventualmente, de fácil execução, uma vez que limitações importantes relacionadas à sensibilidade e especificidade desta técnica ainda são descritas, principalmente quando se utiliza amostras clínicas. Com o intuito de melhor avaliar a eficiência da PCR para o diagnóstico da LVC, foram selecionadas diferentes amostras clínicas (baço, aspirado de linfonodo, pele sem lesão, pele com lesão e amostras de sangue) de 26 cães com sorologia positiva para leishmaniose submetidos à eutanásia pelo Serviço de Vigilância Epidemiológica do município de Embu das Artes - SP. Realizamos uma análise comparativa entre a PCR-RFLP kDNA-HaeIII e PCR-RFLP hsp70-BsaJI/EcoRII com dois métodos diagnósticos tradicionais (parasitológico direto, e cultura in vitro). Amostras clínicas de 28 cães com sorologia negativa para LVC da mesma região foram utilizadas como controle negativo das reações. Notamos que a PCR aprensentou maior sensibilidade em todas as amostras clínicas testadas quando comparadas aos métodos tradicionais. Os resultados apontam que a PCR-RFLP kDNA-HaeIII é a mais eficiente para o diagnóstico da LVC, com um índice de 96,15% de positividade nas amostras de pele com lesão. Quanto à discriminação da espécie de Leishmania envolvida na infecção, nossos resultados de PCR-RFLP kDNA-HaeIII indicam Leishmania chagasi-infantum como o agente etiológico envolvido na infecção e transmissão canina na cidade de Embu das Artes. Por outro lado, a análise da PCR em Tempo Real (qPCR), mostrou que algumas amostras de sangue não apresentavam o padrão associado à Leishmania chagasi-infantum, podendo indicar uma co-infecção com outras parasitoses caninas. Nosso grupo também acompanhou 184 crianças de 4 a 10 anos de idade (população de risco) residentes da mesma região de transmissão autóctone da doença canina, como também foi realizado um levantamento das espécies de flebotomíneos da região (pela SUCEN). Até o momento, não foi encontrado nenhum caso da doença humana, nem a principal espécie transmissora do parasito (Lutzomiya longipalpis). Acreditamos que esses resultados possam contribuir significativamente para aprimorar o diagnóstico e a identificação das espécies Leishmania na LVC.
Title in English
Evaluation of PCR techniques for the identification and characterization of Visceral Leishmaniasis in different tissues of seropositive dogs
Keywords in English
Clinical specimens
kDNA
Leishmania
Molecular diagnostic techniques
Polymerase chain reaction
Visceral leishmaniasis animals
Abstract in English
Currently, one of the major problems related to leishmaniasis is the lack of a specific diagnosis capable of identifying and differentiating Leishmania species quickly and accurately. The development of molecular methods such as Polymerase Chain Reaction ( PCR ) allows the diagnosis of Canine Visceral Leishmaniasis (CVL) to become more accurate and eventually, easy to perform, since that important limitations in terms of sensitivity and specificity of this technique are being described especially when using clinical samples. In order to better evaluate the efficiency of PCR for the diagnosis of CVL, we selected different clinical samples (spleen, lymph node aspirate, skin with and without lesions and blood samples) from 26 dogs with positive serology for leishmaniasis submitted to euthanasia by the Agency of Epidemiological Surveillance of Embu das Artes - SP. Therefore, we performed a comparative analysis between the kDNAPCR-RFLP HaeIII and hsp70PCR-RFLP BsaJI/EcoRII with two traditional diagnostic methods (direct parasitological test, and in vitro culture). Additionally, clinical samples from 28 dogs with negative serology for CVL in the same region were used as negative reactions control. We noted that the PCR showed greater sensitivity in all clinical samples tested when compared with traditional methods. The results indicate that the kDNAPCR-RFLP HaeIII is the most efficient test for the diagnosis of CVL, with a positivity index of 96.15 % in skin lesions samples. Related to the discrimination of the Leishmania species involved in the infection, our results of kDNAPCR-RFLP HaeIII indicate Leishmania infantum chagasi as the agent involved in canine infection in Embu das Artes city. Moreover, the analysis of real-time PCR (qPCR) showed that some blood samples has not showed the same pattern associated with Leishmania infantum chagasi suggesting a possible co-infection with other canine parasite. Our group also followed 184 children between 4 to 10 years old (risk population) living in the same region of autochthonous transmission of canine disease, as well a survey was conducted on the sandfly species in the region (by SUCEN). So far, we found no human infection, nor the main species involved in the transmission of the parasite (Lutzomyia longipalpis). We believe that these results can significantly contribute to the improvement of the diagnosis and identification of Leishmania species involved in the CVL worldwide.
 
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Publishing Date
2014-04-22
 
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