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Thèse de Doctorat
DOI
10.11606/T.99.2017.tde-06022017-143339
Document
Auteur
Nom complet
Júlio César Rente Ferreira Filho
Adresse Mail
Unité de l'USP
Domain de Connaissance
Date de Soutenance
Editeur
São Paulo, 2016
Directeur
Jury
Okay, Thelma Suely (Président)
Kashino, Suely Sanae
Cardoso, André Gustavo Tempone
Komninakis, Shirley Cavalcante Vasconcelos
Lindoso, Ana Angélica Bulcão Portela
Titre en portugais
Monitoramento da carga parasitária por técnica de amplificação quantitativa em sangue e tecidos de camundongos infectados com Trypanosoma cruzi e tratados com benznidazol
Mots-clés en portugais
Doença de Chagas
Medicamento
Parasitismo
Reação em cadeia da polimerase
Tecidos
Resumé en portugais
O tratamento da doença de Chagas é recomendado em pacientes na fase crônica indeterminada com a finalidade de reduzir a carga parasitária, o desenvolvimento de manifestações clínicas tais como as cardiomiopatias e episódios de reativação. Os métodos sorológicos constituem o padrão ouro para a definição de cura pós tratamento, porém não avaliam a carga parasitária tecidual, podendo demorar muitos anos até a soronegativação, enquanto os métodos parasitológicos apresentam baixa sensibilidade na fase crônica. No presente estudo a hemocultura, microscopia ótica, PCR em tempo real (qPCR) e imunoistoquímica foram usados para monitorar a carga parasitária em sangue e órgãos de camundongos Swiss infectados com 2x103 formas da cepa Y de T. cruzi. Foram analisados animais não tratados (NT), tratados somente na fase aguda (TA), somente na fase crônica (TC) e em ambas as fases da infecção (TAC). O tratamento foi realizado com 100 mg/Kg/dia de benznidazol durante 20 dias consecutivos. Amostras foram coletadas no 13º dpi, 26º dpi e 61º dpi (pico da fase aguda, final da fase aguda e fase crônica). Na fase crônica da infecção a microscopia ótica e a hemocultura encontraram 0 e 25% de amostras positivas, respectivamente, e com a qPCR as cargas parasitárias de todas amostras foram quantificadas ao longo do experimento, independentemente do grupo. No 13º dpi, os animais NT apresentaram 16.630,4 enquanto os TA 6.153,6 parasitos/ml de sangue (p<0,05). Os animais TAC foram os que tiveram a maior redução da carga parasitária em sangue e órgãos, muito embora também tenha havido redução nos animais TA (cérebro e coração) e TC (cérebro, coração, músculo e rim) em relação aos NT. Da fase aguda para a crônica houve redução da carga parasitária tanto em sangue quanto em órgãos (mais acentuada). Nos animais NT no 61º dpi, o sangue apresentou carga parasitária comparável a do coração, tecido adiposo, pulmão, intestino, baço e fígado, enquanto nos animais TAC o sangue foi o material biológico com a maior carga parasitária, confirmando que a parasitemia pode e deve ser utilizada para o diagnóstico e monitoramento da infecção por T. cruzi no organismo, em todas as fases da infecção. Ademais, o tecido adiposo atuaria como reservatório de T. cruzi no organismo, uma vez que a carga parasitária sofreu menor redução neste tecido após tratamento. A técnica de imunoistoquímica, realizada em amostras de tecido adiposo e cardíaco, confirmou os resultados da qPCR, fato importante especialmente no 61º dpi, quando as cargas parasitárias foram muito baixas. Portanto, o tratamento realizado em ambas as fases da infecção chagásica seria o mais eficaz para alcançar a redução da carga parasitária de T. cruzi no organismo, em relação ao tratamento realizado apenas uma vez. A qPCR, técnica extremamente sensível, poderia ser empregada para o monitoramento da parasitemia em pacientes tratados na fase crônica indeterminada, detectando falhas terapêuticas ou confirmando a cura etiológica.
Titre en anglais
Monitoring of parasite load by quantitative amplification technique in blood and tissues of mice infected with Trypanosoma cruzi and treated with benzonidazole
Mots-clés en anglais
Chagas disease
Drug
Parasitism
Polymerase chain reaction
Tissues
Resumé en anglais
The treatment of Chagas disease has been recommended in patients in the chronic indeterminate phase to reduce the parasite load, the development of clinical manifestations such as cardiomyopathies and episodes of reactivation. Serological methods are the gold standard for the definition of cure after treatment, but they do not evaluate the parasite load in tissues, and may take many years until reversion, while parasitological methods have low sensitivity in the chronic phase. In the present study, blood culture, optical microscopy, real-time PCR (qPCR) and immunohistochemistry were used to monitor the parasite load in blood and organs of Swiss mice infected with 2x103 forms of the T. cruzi Y strain. Untreated (NT) animals, treated only in the acute phase (TA), only in the chronic phase (TC) and in both phases of the infection (TAC) were analyzed. The treatment was performed with 100 mg/kg/day of benznidazole for 20 consecutive days. Samples were collected at the 13th dpi, 26th dpi and 61st dpi (peak of acute phase, end of acute phase and chronic phase). In the chronic phase of the infection, optical microscopy and blood culture found 0 and 25% of positive samples, respectively, and with qPCR the parasite load levels of all samples were quantified throughout the experiment, regardless of the group. At the 13th dpi, the NT animals presented 16,630.4 whereas the TA animals had 6,153.6 parasites/ml (p<0.05). TAC animals were the ones that had the greatest reduction of the parasite load in blood and organs, although there was also reduction in the TA (brain and heart) and TC (brain, heart, muscle and kidney) animals in relation to NT. From the acute phase to the chronic one there was reduction of the parasite load in both, blood and organs (more pronounced). In NT animals at the 61º dpi, blood samples presented parasite load levels comparable to that of the heart, adipose tissue, lung, intestine, spleen and liver, while in the TAC animals blood was the biological sample with the highest parasite load, confirming that parasitemia can and should be used for the diagnosis and monitoring of T. cruzi infection in the body at all stages of infection. In addition, the adipose tissue would act as reservoir of T. cruzi in the organism, since the parasite load suffered a smaller reduction in this tissue after treatment. The immunohistochemical technique, performed on adipose and cardiac tissues, confirmed the results of qPCR, an important fact especially in the 61º dpi, when parasite load levels were very low. Therefore, the treatment performed in both phases of the chagasic infection would be the most effective to achieve the reduction of parasite burden of T. cruzi in the organism, in comparison with the treatment performed only once. The qPCR, an extremely sensitive and timely technique, could be used to monitoring parasitemia in patients treated in the indeterminate chronic phase, detecting therapeutic failures or confirming the etiological cure.
 
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Date de Publication
2017-02-07
 
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