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Tese de Doutorado
DOI
Documento
Autor
Nome completo
Angela da Silva Machado
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
Lorena, 2019
Orientador
Banca examinadora
Ferraz, André Luis (Presidente)
Gonçalves, Thiago Augusto
Alcalde, Felipe Santiago Chambergo
Segato, Fernando
Título em português
Estudo de glicosil hidrolases das famílias 6 e 7 provenientes de basidiomicetos
Palavras-chave em português
Basidiomicetos
Celobiohidrolases
Hidrólise enzimática
LC MS/MS
Secretoma
Resumo em português
Devido a sua importante atividade celulolítica, basidiomicetos possuem um grande potencial de aplicação na hidrólise da biomassa. Fungos de podridão branca possuem um arsenal completo e robusto de enzimas envolvidas na degradação de todos os componentes da biomassa lignocelulósica. A hidrólise da celulose é um passo crucial na utilização da biomassa celulósica e é geralmente o gargalo no processo bioquímico. As celobiohidrolases (CBH) são as principais enzimas celulolíticas presentes em coquetéis enzimáticos comerciais. A CBH hidrolisa celulose cristalina a unidades solúveis de celobiose, o que a torna uma enzima chave para a produção de açúcares fermentáveis a partir da biomassa. Apesar do enorme potencial biotecnológico, a informação a respeito de celobiohidrolases de basidiomicetos é escassa quando comparada a enzimas de ascomicetos. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi estudar a potencialidade de celobiohidrolases (GH6 e GH7) de dois fungos de podridão branca, Phanerochaete chrysosporium e Trametes versicolor. Para produção de extratos enzimáticos ricos em celobiohidrolases foram feitos cultivos agitados dos fungos em meio basal utilizando avicel com fonte de carbono. Esses extratos serviram para identificação das proteínas produzidas por análise de secretômica por LC - MS/MS, aplicação em ensaios de hidrólise enzimática de medula de cana-de-açucar, bagaço prétratado com sulfito alcalino e bagaço pré-tratado com ácido diluído, e para purificação de uma celobiohidrolase de P. chrysosporium (PcCel7D), que foi avaliada na sacarificação de substratos lignocelulósicos. Foram identificadas 56 e 58 proteínas nos extratos de P. chrysosporium e T. versicolor cultivados por 12 dias em avicel, respectivamente. O resultado da secretômica dos extratos mostrou uma predominância na produção de enzimas envolvidas na degradação de carboidratos, em especial de glicosil hidrolases (GHs), 29 GHs de P. chrysosporium e 32 de T. versicolor. As celobiohidrolases das famílias GH7 e GH6 representaram cerca de 41 % e 36 % da abundância entre as GHs de P. chrysosporium e de T. versicolor, respectivamente. O extrato de P. chrysosporium, com suplementação de β-glicosidase, atingiu os valores obtidos com o extrato comercial Cellic® CTec2 na conversão da glucana da medula de cana-de-açúcar do híbrido H89 (80 % em 72 horas de reação). Já o extrato de T. versicolor proporcionou um percentual de 70 % de conversão de glucana nesse substrato. Os bagaços pré-tratados foram mais recalcitrantes a ação das enzimas dos extratos de P. chrysosporium e T. versicolor, do que observado para Cellic® CTec2. As hidrólises enzimáticas com PcCel7D mostraram conversão de glucana semelhante a CBH de Trichoderma sp. em medula do H89 e bagaço sulfito alcalino (60 % e 30 %, respectivamente), mas apresentou conversão menor em bagaço ácido e avicel. Este é o primeiro trabalho que explora o potencial de sacarificação de extratos enzimáticos destes dois fungos sobre substratos lignocelulósicos.
Título em inglês
Study of glycosyl hydrolases from families 6 and 7 from basidiomycetes
Palavras-chave em inglês
Basidiomycetes
Cellobiohydrolases
Enzymatic hydrolysis
LC MS/MS
Secretome
Resumo em inglês
Due to their important cellulolytic activity, basidiomycetes have a great potential of application lignocellulosic biomass hydrolysis. White rot fungi possess a complete and robust arsenal of enzymes involved in the degradation of all components of the lignocellulosic biomass. The hydrolysis of cellulose is a crucial step in the use of cellulosic biomass and is generally the bottleneck in the biochemical process. Cellobiohydrolases (CBH) are the main cellulolytic enzymes present in commercial enzyme cocktails. CBH hydrolyses crystalline cellulose to soluble units of cellobiose, which makes it a key enzyme to produce fermentable sugars from biomass. Despite the enormous biotechnological potential, the information about basidiomycete cellobiohydrolases is scarce when compared to ascomycetes enzymes. In this context, the objective of this work was to study the potentiality of cellobiohydrolases (GH6 and GH7) of two white rot fungi, Phanerochaete chrysosporium and Trametes versicolor. To produce enzymatic extracts rich in cellobiohydrolases, stirring cultures of fungi were made in basal medium using avicel with carbon source. These extracts were used to identify the proteins produced in the cultures (by LC - MS / MS analysis), applied in enzymatic hydrolysis tests of sugarcane pith, sugarcane bagasse pre - treated with alkaline sulfite and pre - treated with dilute acid, and for purification of a cellobiohydrolase from P. chrysposorium (PcCel7D), which was evaluated in the saccharification of lignocellulosic substrates. 56 and 58 proteins were identified in extracts of P. chrysosporium and T. versicolor cultivated for 12 days in avicel, respectively. The extracts showed a predominance of enzymes involved in the degradation of carbohydrates, especially glycosyl hydrolases (GHs), 29 GHs of P. chrysosporium and 32 of T. versicolor. The cellobiohydrolases of the GH7 and GH6 families accounted for approximately 41% and 36% of the abundance between the GHs of P. chrysosporium and T. versicolor, respectively. The extract of P. chrysosporium, with β-glucosidase supplementation, reached the values obtained with the commercial extract Cellic® CTec2 in the conversion of glucan of sugarcane pith of hybrid H89 (80% in 72 hours of reaction). The extract of T. versicolor provided 70% glucan conversion in this substrate. The pre-treated sugarcane bagasses were more recalcitrant to the action of the enzymes from P. chrysosporium and T. versicolor, than observed for Cellic® CTec2. Enzymatic hydrolysis with PcCel7D showed conversion of glucan similar to CBH of Trichoderma sp. In H89 pith and alkaline sulphite bagasse (60% and 30%, respectively), but presented lower conversion in acidic bagasse and avicel. This is the first work that explores the potential of saccharification from the enzymatic extracts produced by these two fungi on lignocellulosic substrates.
 
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BIT19005_C.pdf (3.27 Mbytes)
Data de Publicação
2019-11-28
 
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