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Disertación de Maestría
DOI
Documento
Autor
Nombre completo
Sarah de Souza Queiroz
Dirección Electrónica
Instituto/Escuela/Facultad
Área de Conocimiento
Fecha de Defensa
Publicación
Lorena, 2019
Director
Tribunal
Felipe, Maria das Graças de Almeida (Presidente)
Arruda, Priscila Vaz de
Pessoa Junior, Adalberto
Silva, Tatiane da Franca
Título en portugués
Identificação e quantificação da expressão dos genes envolvidos no transporte de xilose na levedura Candida guilliermondii FTI 20037
Palabras clave en portugués
Candida tropicalis
Glicose
Proteínas transportadoras
Xilitol
Xilose
Resumen en portugués
Biomassas lignocelulósicas são abundantes no planeta e fontes ricas em carboidratos que podem ser empregadas na indústria biotecnológica e então aproveitadas em diferentes bioprocessos, a exemplo da produção de xilitol. Os processos industriais que empregam microrganismos capazes de promover a bioconversão desta matéria prima são majoritariamente concentrados na utilização de hexoses advindas da fração celulósica, enquanto a fração hemicelulósica, rica em pentoses, principalmente xilose, necessita de melhorias para o estabelecimento de um bioprocesso industrial. As leveduras do gênero Candida, que possuem a maquinaria metabólica necessária para metabolizar a molécula de xilose, possuem a capacidade de conversão desta molécula em xilitol, um açúcarálcool de grande valor comercial. No metabolismo de xilose é importante considerar a proporção de NAD(P)H:NAD(P)+, uma vez que ao manter o poder redutor, será favorecida a atividade da xilose redutase (XR), enzima chave no primeiro passo da conversão de xilose a xilitol que necessita da forma reduzida como cofator. Sendo assim, em meios formulados com a mistura de pentoses e hexoses, a exemplo de hidrolisados hemicelulósicos, é importante considerar a presença da molécula de glicose, e a proporção entre estes dois açúcares no meio, em função dos efeitos gerados na assimilação destes monossacarídeos. Avanços das pesquisas envolvendo genética molecular e sinalização celular evidenciaram a existência de uma relação entre o transporte de açúcares e o fluxo metabólico, cuja importância foi demonstrada partir da identificação de proteínas transportadoras de xilose de alta afinidade em leveduras capazes de metabolizar pentoses. Considerando a potencialidade de Candida guilliermondii FTI 20037 na bioconversão de xilose em xilitol, este trabalho teve o objetivo de identificar e quantificar a expressão dos genes envolvidos no transporte de xilose nesta levedura. No entanto, como ponto de partida, foram realizados experimentos de confirmação de espécie, com base na sequência região do rDNA, foi encontrado que a linhagem Candida guilliermondii FTI 20037 utilizada na pesquisa se trata da espécie Candida tropicalis. Sendo assim, após a posterior aplicação de ferramentas de bioinformática/utilização de bancos de dados in silico, foram identificadas 16 possíveis proteínas transportadoras de xilose no genoma de Candida tropicalis. A relação filogenética entre elas foi construída, sendo duas proteínas potenciais transportadoras selecionadas (CtGX2 e CtXUT1). Ensaios de cinética de consumo de xilose pela levedura realizados sob diferentes condições de fontes de carbono xilose, glicose e a mistura destes monossacarídeos como composição principal do meio de cultivo permitiram a avaliação do padrão de consumo e posterior determinação da expressão relativa dos genes codificantes das respectivas proteínas via qPCR. Foi determinado que o intervalo de 21-36h de fermentação é correspondente ao pico de absorção de xilose pela C. tropicalis e a correlação obtida a partir destes dados com os resultados de expressão gênica apontaram que, ambos os genes selecionados são capazes de transportar a molécula de xilose, embora com afinidades distintas, sendo que CtXUT1 apresentou indícios de especificidade para o transporte de xilose ao ser expresso apenas na condição de depleção de glicose do meio de cultivo.
Título en inglés
Identification and quantification of the expression of genes involved in xylose transport in Candida guilliermondii FTI 20037
Palabras clave en inglés
Candida tropicalis
Glucose
Transporter proteins
Xylitol
Xylose
Resumen en inglés
Lignocellulosic biomass is an abundant source of carbohydrates in the planet that can be used by biotechnology industry in several bioprocesses, having the production of xylitol as an example. Industrial processes that employ microorganisms able to promote the bioconversion of this raw material are limited to the utilization of hexoses, provided by the cellulosic fraction of the material, while the hemicellulosic fraction (rich in pentoses, specially xylose) still need improvements before being implemented in industrial bioprocesses. Yeasts belonging to the Candida genre have the required metabolic machinery for the metabolization of the xylose molecule, converted in the xylitol molecule, a commercial highly valued sugar-alcohol. It is important to consider, in the xylose metabolism, the proportion of NAD(P)H:NAD(P)+, once the activity of the xylose reductase, key enzyme in the first step in the bioconversion of xylose into xylitol, is favored by the maintenance of reduction power, provided by the reduced form of this cofactor. In that context, in mediums composed by the blend of both pentoses and hexoses, as in hemicellulosic hydrolysates, it is important to consider the presence of the glucose molecule and its proportion in relation to xylose, in regard of the affects generated by their assimilation. Advances in research involving molecular genetics and metabolomics have evidenced a hypothetic correlation between the transportation of sugars and metabolic flux, whose importance was demonstrated by the identification of xylose carrier proteins in yeasts able to metabolize pentoses. Considering the potential of Candida guilliermondii FTI 20037 in the bioconversion of xylose to xylitol, the objective of the following research was to identity and quantify the expression of genes involved in the transport of xylose in this yeast. As a starting point, species-confirming experiments were conducted and, based on rDNA sequences, it was identified that the lineage of Candida guilliermondii FTI 20037 used in this study wasa Candida tropicalis lineage. Posterior application of bioinformatics and data banks in situ, 16 possible xylose carrier proteins were found in Candida tropicalis genome. The phylogenetic relation between them was constructed and appointed two potential transporting proteins selected (CtGX2 and CtXUT1). Kinetic assays of xylose consumption by the yeast in different carbono sources conditions (xylose, glucose and blends of both monosaccharides) allowed the evaluation of consumption patterns and posterior determination of relative gene expression of the respective proteins by qPCR. It was determined that peak xylose absorption occurred in the 21h-36h interval and the correlation of this and gene expression. data appointed that both genes are capable of transport xylose with distinct affinities, while CtXUT1 presented selective behavior to the transportation of xylose once it was only expressed in a glucose depleted medium situation.
 
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BID19003_C.pdf (15.41 Mbytes)
Fecha de Publicación
2019-11-28
 
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