• JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
 
  Bookmark and Share
 
 
Disertación de Maestría
DOI
10.11606/D.97.2014.tde-07112014-154425
Documento
Autor
Nombre completo
Ana Paula Almeida dos Santos
Dirección Electrónica
Instituto/Escuela/Facultad
Área de Conocimiento
Fecha de Defensa
Publicación
Lorena, 2014
Director
Tribunal
Ferraz, André Luiz (Presidente)
Milagres, Adriane Maria Ferreira
Squina, Fabio Marcio
Título en portugués
Desenvolvimento de um método para a determinação da atividade de esterases usando material lignocelulósico como substrato
Palabras clave en portugués
Ácido ferúlico
Biomassa
Cana de açúcar
Feruloil esterase
Hidrólise enzimática
Resumen en portugués
As feruloil esterases são enzimas relevantes para o processo de hidrólise de materiais lignocelulósicos oriundos de gramíneas. Estas enzimas são tradicionalmente determinadas com o emprego de substratos sintéticos de baixa massa molar. Entretanto, as atividades determinadas a partir desses ensaios não se correlacionam adequadamente com a ação das enzimas em substratos complexos e insolúveis como os materiais lignocelulósicos. Neste sentido, o presente trabalho visou desenvolver um método apropriado para medir a atividade de feruloil esterases utilizando um material lignocelulósico como substrato. Para isso, as medulas de híbridos de cana-de-açúcar com baixo teor de lignina e de um cultivar de referência com elevado teor de lignina foram usadas para preparar substratos de baixa recalcitrância usados na determinação da atividade de feruloil esterases de 3 origens diferentes. As medulas foram extraídas com água para remoção de sacarose e posteriormente analisadas quanto à composição química. As medulas foram ainda submetidas a uma etapa de pré-hidrólise com celulase comercial por 4 horas para preparar um substrato menos recalcitrante e adequado para a ação das enzimas. Após a avaliação do efeito da carga de feruloil esterases na cinética de hidrólise dos ésteres de ácido ferúlico, foi definido que os ensaios enzimáticos deveriam ser realizados com um tempo fixo de 5 minutos a fim de determinar a atividade numa faixa de conversão dos ésteres que fosse da ordem de 2%, assegurando a determinação na região de velocidade máxima de reação. Idealmente, o método foi desenhado para empregar diluições da enzima que gerassem dados de conversão levemente menores e maiores do que 2% de conversão, o que permitiu a determinação exata da carga de enzima necessária para converter 2% de éster do ácido ferúlico em ácido após 5 min de reação por interpolação de dados. As condições de reação foram fixadas em 40°C e pH 6,3. Os níveis de atividade e as reprodutibilidades experimentais determinadas para as 3 enzimas se mostraram dependentes do substrato, principalmente associadas ao teor inicial de lignina observado nas medulas in natura. Tomando as determinações de atividade da feruloil esterase de rúmen como exemplo, os dados obtidos, expressos em UI/?g de proteína, foram: 2,3 ± 0,2, 2,0 ± 0,8 e 0,6 ± 0,5, respectivamente para os substratos oriundos das medulas que continham originalmente 13,0 ± 0,3, 12,8 ± 0,5 e 19,1 ± 0,1% de lignina. Empregando os substratos oriundos de medulas com baixo teor de lignina original, o método se mostrou adequado para estudar os efeitos de variáveis como temperatura e pH do meio reacional sobre a atividade enzimática. No caso da feruloil esterase de rúmen, os estudos mostraram uma temperatura ótima de reação de 40°C e atividades crescentes em função do pH, com máximo na região de 6,3 a 7,2. Pode-se concluir que o trabalho permitiu a elaboração de uma metodologia adequada para a determinação de feruloil esterases empregando um substrato lignocelulósico, desde que este substrato seja preparado a partir de medulas de cana com baixa recalcitrância decorrente do baixo teor original de lignina.
Título en inglés
Development of a method to determine the activity of esterases using a lignocellulosic material as a substract
Palabras clave en inglés
Biomass
Enzymatic hydrolysis
Ferulic acid
Feruloyl esterase
Sugarcane
Resumen en inglés
Feruloyl esterases are important enzymes acting on the hydrolysis of lignocellulosic materials from grasses. These enzymes are traditionally determined using synthetic low molar mass substrates. However, the activities determined through these assays do not correlate with the action of the enzymes on complex and insoluble substrates such as lignocellulosic materials. According to this, the present work aimed to develop an appropriate method to measure feruloyl esterase activities using a lignocellulosic material as substrate. Pith regions, recovered from low lignin content sugarcane hybrids and from a high lignin content reference cultivar, were used to prepare low recalcitrance lignocellulosic substrates, used to determine the activity of 3 different feruloyl esterases. The pith samples were extracted with water to remove sucrose and then analyzed concerning its chemical composition. They were further subjected to a prehydrolysis step with commercial cellulase for 4 hours to prepare a less recalcitrant and proper substrates for the action of the feruloyl esterases. After evaluating the effect of enzyme loading on the hydrolysis kinetics of the ferulic acid esters, it was defined that the enzymatic assays should be done at a fixed time of 5 minutes, in order to determine the enzymatic activity in the region of maximal hydrolysis rate. Ideally, the method was designed to use enzyme dilutions that provide ferulic acid ester conversions in the range of 2 %, which allowed the exact determination of the enzyme load necessary to convert 2% of ferulic acid ester in acid after 5 minutes of reaction by interpolating data. The reaction conditions were fixed at 40°C and pH 6.3. The activity levels and the experimental reproducibility determined for the 3 enzymes showed to be dependent of the substrate, specially associated with the initial lignin content of each material. Taking the rumen feruloyl esterase activities as example, the data obtained in UI/?g of protein were 2.3 ± 0.2, 2.0 ± 0.8 e 0.6 ± 0.5, respectively for the substrates from sugarcane piths containing 13.0 ± 0.3, 12.8 ± 0.5 and 19.1 ± 0.1% of lignin. Employing the substrates with low lignin contents, the method showed to be appropriate to study the effects of variables such as the reaction temperature and pH on the enzymatic activity. For rumen feruloyl esterase, the studies showed optimum temperature at 40°C and increasing activities for increasingly pHs, with the maximum in the range 6.3-7.2. In conclusion, the work provided a proper methodology to determine feruloyl esterase activity using a lignocellulosic substrate, but the substrate needs to be prepared from a non-recalcitrance sugarcane pith that was observed in samples with low initial lignin content.
 
ADVERTENCIA - La consulta de este documento queda condicionada a la aceptación de las siguientes condiciones de uso:
Este documento es únicamente para usos privados enmarcados en actividades de investigación y docencia. No se autoriza su reproducción con finalidades de lucro. Esta reserva de derechos afecta tanto los datos del documento como a sus contenidos. En la utilización o cita de partes del documento es obligado indicar el nombre de la persona autora.
BID14007_C.pdf (1.54 Mbytes)
Fecha de Publicación
2014-11-07
 
ADVERTENCIA: Aprenda que son los trabajos derivados haciendo clic aquí.
Todos los derechos de la tesis/disertación pertenecen a los autores
Centro de Informática de São Carlos
Biblioteca Digital de Tesis y Disertaciones de la USP. Copyright © 2001-2021. Todos los derechos reservados.