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Doctoral Thesis
DOI
10.11606/T.97.2017.tde-06022017-102724
Document
Author
Full name
Thales Henrique de Freitas Costa
E-mail
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
Lorena, 2016
Supervisor
Committee
Ferraz, André Luis (President)
Driemeier, Carlos Eduardo
Otoni, Wagner Campos
Romanel, Elisson Antônio da Costa
Title in Portuguese
Estudo da deposição de hemiceluloses na parede celular de gramíneas e seu efeito sobre a recalcitrância
Keywords in Portuguese
Cana-de-açúcar
Hemicelulose
Imunofluorescência
Recalcitrância
Sorgo
Abstract in Portuguese
Este estudo avaliou a ocorrência e as características da hemicelulose em gramíneas e sua correlação com a recalcitrância da biomassa lignocelulósica frente à digestão enzimática. As amostras de gramíneas incluíram seis híbridos de cana-de-açúcar com teores variados de lignina e hemicelulose, além de uma variedade de sorgo forrageiro. Os entrenós de cana-de-açúcar madura foram fracionados em três regiões distintas: medula, interface medula-córtex e córtex. O sorgo foi fracionado em: medula e córtex. As medulas apresentaram alto teor de glucanas (40-55%) e baixo teor de ligninas (14-22%). O teor de xilanas aumentou da medula (14-20%) para o córtex (20-23%). A composição da hemicelulose também foi avaliada. Xilose (9- 23%), glicose (1-12%) e arabinose (1-4%) foram os monômeros mais abundantes ao fim das análises. As medulas apresentaram xilanas mais arabinosiladas e alta deposição de glucanas não celulósicas. O teor de (1 ? 3),(1 ? 4)-ß-D-glucanas foi elevado nas medulas (1,4-15%) e diminuiu no sentido do córtex (0,1 - 1%). As arabinoxilanas de cana-de-açúcar foram submetidas à um estudo estrutural, confirmando que as cadeias de xilanas são substituídas. A lignina foi avaliada por pirólise acoplada com espectrometria de massas, revelando uma estrutura HGS em cana-de-açúcar e uma razão S/G sem um padrão progressivo entre as frações do entrenó. As amostras de cana-de-açúcar também foram avaliadas quanto à distribuição de hemiceluloses entre os diferentes tecidos e células através de microscopia de imunofluorescência. Uma análise preliminar revelou que anticorpos específicos para xilana e (1 ? 3),(1 ? 4)-ß-D-glucana se ligaram aos extratos hemicelulósicos. Cortes das amostras foram tratados com os anticorpos CRCC-M140 e LM11 (para xilanas menos e mais substituídas) e outro contra (1 ? 3),(1 ? 4)-ß-Dglucanas. Epítopos de xilanas menos substituídas estiveram presentes principalmente em feixes vasculares e não foram detectados em parênquima de medulas. Epítopos de arabinoxilana foram encontrados em todas as frações e tipos celulares. A imunofluorescência de (1-->3),(1-->4)-ß-D-glucanas mostrou que estes estão depositados principalmente em células do parênquima de medulas; em feixes vasculares estes foram detectados apenas em células do floema e protoxilema. O índice de cristalinidade foi estimado para as amostras. Altos índices de cristalinidade foram encontrados para amostras do córtex (0,44-0,56). As amostras (sem prétratamentos) foram digeridas com enzimas celulolíticas comerciais. As medulas foram hidrolisadas mais facilmente (32-85% de conversão de glucanas após 72h), enquanto amostras do córtex foram mais recalcitrantes (2-9%). As interfaces apresentaram conversões intermediárias (7-46%). A hidrólise da xilana ocorreu em menor escala para todas frações, possivelmente devido ao alto grau de substituição das xilanas. A digestibilidade das glucanas foi diretamente proporcional ao grau de substituição das xilanas (R2=0,86) e ao teor de (1-->3),(1-->4)-ß-D-glucanas nas amostras (R2 = 0,92). Entre as amostras de gramíneas, aqueles que apresentam menor recalcitrância reuniram características que incluem baixo teor de lignina, alto teor de (1-->3),(1-->4)- ß-D-glucanas e alto grau de substituição das xilanas. Essas características poderiam ser utilizadas como indicadores nos processos de geração e seleção de plantas para a produção de biomassas lignocelulósicas de elevada digestibilidade.
Title in English
Study of the hemicellulose deposition in the cell wall of grasses as related to recalcitrance
Keywords in English
Hemicellulose
Immunofluorescence
Recalcitrance
Sorghum
Sugarcane
Abstract in English
This work assessed the occurrence and features of hemicellulose in grasses as related to lignocellulosic biomass recalcitrance to enzymatic hydrolysis. The grasses materials included six sugarcane hybrids with varying lignin and hemicellulose content, besides a variety of forage sorghum. The mature sugarcane internodes were dissected into three different regions: pith, pith-rind interface and rind. The sorghum was dissected into pith and rind. Pith samples presented high glucan content (40- 55%) and low lignin content (14-22%). The xylan content increased from pith region (14-20%) to rind (20-23%). Hemicellulose composition was also assessed. Xylose (9- 23%), glucose (1-12%) and arabinose (1-4%) were the most abundant monomers at the end of the analyzes. Pith samples had the most arabinosilated xylans and high content of non-cellulosic glucans. The (1-->3),(1-->4)-ß-D-glucan content was high in piths (1,4-15%) and decreased towards rind (0,1-1%). The sugarcane arabinoxylans were submitted to a study of their structure, which confirmed the xylan backbone was substituted. Lignin was assessed by pyrolysis coupled with mass spectrometer, which showed an HGS polymer in sugarcane and a S/G ratio without a progressive pattern between internode fractions. The sugarcane samples were also evaluated as related to hemicellulose distribution between different tissues and cells by immunofluorescence microscopy. A preliminary analysis showed that antibodies specific to xylan and mixed-linkage glucan bound to hemicellulose extracts. Plant sections were treated with the antibodies CRCC-M140 and LM11 (for less and more substituted xylans) and another one against mixed-linkage glucans. Less decorated xylan epitopes were mainly present in vascular bundles and were not detected in pith parenchyma. Arabinoxylan epitopes were found in all fractions and cell types. The mixed-linkage glucan immunofluorescence showed they were mainly deposited in parenchyma cells from piths; they were only detected in phloem and protoxylem cells in vascular bundles. The crystallinity index was estimated for all samples. High crystallinity indexes were found in rind samples (0,44-0,56). The non-pretreated materials were digested with commercial cellulolytic enzymes. Piths were easily hydrolyzed (32-85% of glucan conversion after 72h), while rind samples were more recalcitrant (2-9%). Interface samples showed intermediary conversions (7-46%). Xylan hydrolysis occurred in a less extent for all fractions, possibly due to a high substitution level on xylans. The glucan digestibility was proportionally related to the substitution level of xylan (R2=0,86) and the mixed-linkage glucan content (R2 = 0,92). Among the grasses samples, those with lower recalcitrance had features such as low lignin content, high mixed-linkage glucan content and high substitution level of xylans. These features could serve as indicators in the process of generation and selection of plants for lignocellulosic biomass production with high digestibility degree.
 
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Publishing Date
2017-02-06
 
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