Os RNAs circulares (circRNAs) são uma nova classe de RNA que forma laços (loops) contínuos fechados covalentemente. Como os RNAs longos e não codificadores, as funções efetivas dos circRNAs dependem principalmente das características de suas sequências e estruturas e há um crescente corpo de papéis funcionais atribuídos aos circRNAs. Por exemplo, os circRNAs atuam como esponjas de microRNAs que modulam indiretamente a expressão gênica de genes codificadores de proteínas. Além disso, a desregulação da expressão de circRNAs têm sido associada a várias patologias humanas, como o câncer. Em termos de expressão, estudos relataram centenas de circRNAs como mais abundantes do que seus correspondentes mRNAs lineares, não apenas nos tecidos, mas também no sangue. O câncer colorretal (CRC) é o terceiro câncer mais diagnosticado e a quarta principal causa de mortes relacionadas ao câncer no mundo. Estudos em linhas de células CRC e tecidos CRC mostram uma redução geral na abundância de circRNA em comparação com tecidos saudáveis, permitindo que as células CRC sejam inesperadas e apresentem proliferação descontrolada, por exemplo. Metodologia: Caracterizamos e estudamos o perfil de expressão dos circRNAs em linhagens de células CRC com o objetivo de entender melhor o papel desses RNAs na tumorigênese e progressão do câncer. Primeiro, os dados de sequenciamento de RNA (RNA-seq) de duas linhas celulares comerciais do mesmo paciente primário e metastático de CRC (SW480 e SW620, respectivamente) foram obtidos a partir de uma plataforma Illumina NextSeq. Em seguida, foram utilizados dois métodos de preparação da biblioteca de sequenciamento de RNA: i) o protocolo padrão sugerido por Illumina; ii) e um protocolo interno para melhorar a detecção de circRNAs. Finalmente, todos os dados de RNA-seq foram alinhados ao genoma de referência (GRCh38) e usados como entrada para identificar circRNAs por meio do algoritmo CircExplorer e outros pipelines de computação internos. As metodologias RSEM e Kallisto também foram usadas para gerar o perfil de expressão gênica de todas as linhagens celulares e preparações de bibliotecas. O pacote do R, edgeR, foi utilizado para normalização e seleção dos genes diferencialmente expressos. Resultados: Nossos resultados mostraram que nosso protocolo interno de preparação da biblioteca de sequenciamento de RNA detectou 70% mais circRNAs do que uma preparação padrão comumente usada. Em seguida, avaliando o número de circRNAs expressos nas linhagens celulares primária (SW480) e metastática (SW620), encontramos 3.991 circRNAs expressos diferencialmente (únicos, FDR <0,05; log2 fold change> 2 ou <-2), 1.936 e 2.055 circRNA super e sub expressos, respectivamente, na linhagem de tumor primário versus a metastática. Ao avaliar as vias celulares dos genes que geram circRNAs, identificamos vários candidatos envolvidos na tumorigênese e na progressão do câncer por vias epigenéticas, mas também, diversos circRNAs que parecem estar agindo em mecanismos e vias de supressão tumoral, em ambas as linhagens. Portanto, em resumo, este trabalho traz contribuições importantes para entendermos melhor o papel dos circRNAs no câncer colorretal e também suas contribuições na progressão tumoral de tumor primário à metástase, e como eles podem ser importantes como biomarcadores para essa patologia.

Circular RNAs (circRNAs) are a new class of RNA that form continuous covalently closed loops. Like long, non-coding RNAs, the actual functions of circRNAs depend mainly on the characteristics of their sequences and structures, and there is a growing body of functional roles assigned to circRNAs. For example, circRNAs act as microRNA sponges that indirectly modulate gene expression of protein-coding genes. Furthermore, dysregulation of circRNA expression has been associated with several human pathologies, such as cancer. In terms of expression, studies have reported hundreds of circRNAs as more abundant than their corresponding linear mRNAs, not just in tissues but also in blood. Colorectal cancer (CRC) is the third most diagnosed cancer and the fourth leading cause of cancer-related deaths worldwide. Studies in CRC cell lines and CRC tissues show an overall reduction in circRNA abundance compared to healthy tissues, allowing CRC cells to be unexpected and proliferate uncontrolled, for example. Methodology: We characterized and studied the expression profile of circRNAs in CRC cell lines in order to better understand the role of these RNAs in tumorigenesis and cancer progression. First, RNA sequencing data (RNA-seq) from two commercial cell lines from the same primary and metastatic CRC patient (SW480 and SW620, respectively) were obtained from an Illumina NextSeq platform. Then, two methods of preparing the RNA sequencing library were used: i) the standard protocol suggested by Illumina; ii) and an internal protocol to improve detection of circRNAs. Finally, all RNA-seq data were aligned to the reference genome (GRCh38) and used as input to identify circRNAs through the CircExplorer algorithm and other internal computation pipelines. RSEM and Kallisto methodologies were also used to generate the gene expression profile of all cell lines and library preparations. The R package, edgeR, was used for normalization and selection of differentially expressed genes. Results: Our results showed that our in-house RNA sequencing library preparation protocol detected 70% more circRNAs than a commonly used standard preparation. Then, evaluating the number of circRNAs expressed in the primary (SW480) and metastatic (SW620) cell lines, we found 3,991 differentially expressed circRNAs (single, FDR <0.05; log2 fold change> 2 or <-2), 1,936 and 2,055 super and under expressed circRNA, respectively, in the primary versus metastatic tumor lineage. By evaluating the cellular pathways of genes that generate circRNAs, we identified several candidates involved in tumorigenesis and cancer progression through epigenetic pathways, but also several circRNAs that seem to be acting on tumor suppression mechanisms and pathways, in both strains. Therefore, in summary, this work makes important contributions to better understand the role of circRNAs in colorectal cancer and also their contributions in tumor progression from primary tumor to metastasis, and how they can be important as biomarkers for this pathology.