A metagenômica shotgun permite a caracterização da composição taxonômica e do potencial funcional de microbiomas, independente de isolamento e de cultivo dos microrganismos. A análise funcional de microbiomas é realizada diretamente nas reads, nos contigs ou em MAGs (Metagenome Assembled Genome). Embora muito utilizada, a análise através de MAGs é limitada visto que os MGEs (Mobile Genetic Element) não são geralmente contemplados na montagem. MGEs, como exemplo os plasmídeos, atuam na disseminação de ARGs (Antibiotic Resistance Gene) e contribuem para o aumento da resistência antimicrobiana. A recuperação de MGEs e a prospecção de ARGs a partir de dados metagenômicos pode auxiliar na compreensão da função que eles exercem na comunidade microbiana. Neste trabalho, investigamos o mobiloma (conjunto de MGEs), com ênfase no plasmidoma (conjunto de plasmídeos), e o resistoma (conjunto de ARGs) em dados de metagenômica shotgun de short reads da compostagem termofílica do Parque Zoológico de São Paulo. Esses dados foram obtidos em trabalhos anteriores e possibilitaram elucidar a composição do microbioma da compostagem e realizar sua caracterização funcional, principalmente quanto ao seu potencial de degradação da biomassa lignocelulósica. Entretanto, o conteúdo de MGEs e de ARGs, foi pouco explorado. Para realizar este estudo, estabelecemos uma metodologia de análise para a recuperação dos MGEs e para a prospecção dos ARGs, a partir da integração de distintas ferramentas computacionais e bancos de dados. As reads brutas foram submetidas a filtro de qualidade e montadas em contigs dos quais ~235 mil contigs (8,9% do total) tiveram tamanho 1 kpb. Desses contigs, recuperamos 24896 contigs com 5 ferramentas computacionais de recuperação de plasmídeos. Em seguida, 652 contigs, preditos como sendo de plasmídeos por pelo menos duas das ferramentas de recuperação de plasmídeos, foram submetidos a anotação e comparados ao RefSeq de plasmídeos (NCBI Reference Sequence Database). Em 649 contigs foram encontrados 17112 ORFs que tiveram similaridade contra 3 bases de dados, destas 50% estavam associadas a genes essenciais da base DEG (Database of Essential Genes), 77% tiveram similaridade com o RefSeq e 76% com o COG (The Clusters of Orthologous Genes). Dentre os contigs preditos como plasmídeos, 230 apresentaram características mais robustas de plasmídeos, dos quais apenas uma pequena fração de contigs foram similares a 4 plasmídeos encontrados nas bases de dados interrogadas. Nos contigs de plasmídeos identificamos uma alta abundância de genes de transposases, de proteínas de replicação e manutenção plasmidial além de mecanismos de defesa incluindo resposta a estresse oxidativo, resistência a metais pesados e genes de resistência a aminoglicosídeos e a sulfonamidas. Cabe destacar que os ARGs identificados estavam mais associados aos contigs de cromossomos do que de plasmídeos. Observamos que vários dos contigs de plasmídeos estão presentes em mais de uma das amostras coletadas ao longo do processo de compostagem. Verificamos que reads do metatranscritoma da compostagem mapearam em genes de transposases e de início de replicação de alguns dos contigs de plasmídeos sugerindo que tais elementos estão expressos. Embora ainda existem desafios na montagem de sequências repetitivas que dificultam a recuperação de plasmídeos, a metodologia que estabelecemos possibilitou a recuperação mais precisa de contigs de plasmídeos a partir de dados de metagenômica shotgun de short reads.

Shotgun metagenomics allows the characterization of the taxonomic composition and functional potential of microbiomes, independent of the isolation and cultivation of microorganisms. Functional analysis of microbiomes is carried out directly on reads, contigs or MAGs (Metagenome Assembled Genomes). Although widely used, analysis using MAGs is limited because MGEs (Mobile Genetic Elements) are generally not included in the assembly. MGEs, for example plasmids, can disseminate ARGs (Antibiotic Resistance Gene) and contribute to the increase in antimicrobial resistance. The recovery of MGEs and the prospecting of ARGs from metagenomic data can help to understand the role they play in the microbial community. In this work we investigated the mobilome (collection of MGEs), with an emphasis on the plasmidome (collection of plasmids), and the resistome (collection of ARGs) in shotgun metagenomic data from short reads of the thermophilic composting of the São Paulo Zoo Park. These data obtained in a previous work enabled the elucidation of the composition of the composting microbiome and its functional characterization, particularly the potential for degrading lignocellulosic biomass. However, the content of MGEs and ARGs has been little explored. To carry out this study, we established an analysis methodology for recovering MGEs and prospecting ARGs, based on the integration of different computational tools and databases. The raw reads were subjected to a quality filter and assembled into contigs from which ~235 thousand contigs (8.9% of the total) were 1 kbp in size. Out of these, we recovered 24896 contigs with 5 computational plasmid recovery tools. Next, 652 contigs, predicted to be plasmids by at least two of the plasmid recovery tools, were subjected to annotation and compared to plasmid RefSeq (NCBI Reference Sequence Database). In 649 contigs, 17112 ORFs were found to have similarity against 3 databases, of which 50% were associated with essential genes from the DEG database (Database of Essential Genes), 77% had similarity with RefSeq and 76% with COG (The Clusters of Orthologous Genes). Among the contigs predicted as plasmids, 230 showed more robust plasmid characteristics, of which only a small fraction of contigs were similar to 4 plasmids found in the databases interrogated. In the plasmid contigs we identified a high abundance of genes encoding transposase, plasmid replication and maintenance proteins, as well as defense mechanisms including response to oxidative stress, resistance to heavy metals and resistance to aminoglycosides and sulfonamides. It is worth noting that the ARGs identified were more associated with chromosome contigs than plasmid contigs. We observed that several of the plasmid contigs were present in more than one of the samples collected throughout the composting process. We found that reads from the composting metatranscriptome mapped onto transposase and replication initiation genes of some of the plasmid contigs, suggesting that these elements are expressed. Although there are still challenges in assembling repetitive sequences that make it difficult to recover plasmids, the methodology we established enabled more accurate recovery of plasmid contigs from short reads shotgun metagenomics data.