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Tese de Doutorado
DOI
https://doi.org/10.11606/T.95.2019.tde-03122019-115209
Documento
Autor
Nome completo
Junier Marrero Gutierrez
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Paulo, 2019
Orientador
Banca examinadora
Koide, Tie (Presidente)
Martinez, Cristina Elisa Alvarez
Pinheiro, Daniel Guariz
Silva Neto, José Freire da
Título em português
Regulação pós-transcricional em Halobacterium salinarum NRC-1: caracterização do gene VNG_RS05855
Palavras-chave em português
asRNA
Atividade in vitro
bioinformática
Ensaios fenotípicos
Halobacterium salinarum NRC-1
Metalo-β-lactamases
Regulação pós-transcricional
RNA-seq
RNases
VNG_RS05855
Resumo em português
A família das enzimas metalo-β-lactamases compreende um grupo de proteínas com participação no metabolismo dos ácidos nucleicos. Nos genomas procariotos, muitas proteínas estão anotadas como potenciais metalo-β-lactamases, porém sem função comprovada. Este é o caso do gene VNG_RS05855 de Halobacterium salinarum NRC-1, organismo em que os principais atores da regulação pós-transcricional, as RNases, também são pouco conhecidos. Nesta pesquisa, relatamos a primeira caracterização da metalo-β-lactamase VNG_RS05855 da arquéia halofílica H. salinarum NRC-1 no contexto da regulação pós-transcricional, mediante a integração de abordagens experimentais e computacionais. VNG_RS05855 compartilha similaridade de sequência com proteínas descritas com atividade ribonucleolítica, porém a ausência de domínios específicos (exosite) coloca em dúvida a afirmação desta função. O gene apresenta uma expressão relativa basal durante o crescimento, que se altera diante de perturbações ambientais e genéticas, e é correlacionada a outras RNases como ocorre com RNase de outros organismos. Embora a ausência do gene VNG_RS05855 não tenha afetado nem a viabilidade nem o crescimento da linhagem nocaute (VNG_RS05855), foram observadas ligeiras diferenças fenotípicas em relação a linhagem controle frente a baixas concentrações de metais de transição (Zn2+ , Cu2+ , Fe2+ , Mn 2+ , Co 2+ ), ao metalóide NaAsO2 , ao agente oxidante H2O2 e a variações de sais do meio de cultura. Outros fatores que poderiam ser responsáveis por essas diferenças como a liberação de vesículas de gás e a produção de bacteriorodopsina foram descartados. Também foram identificadas diferenças no pH diante das transições metabólicas promovidas por mudanças na disponibilidade de nutrientes e luz. Ao analisar a sobrevivência da linhagem nocaute em concentrações semi-letais de Cu 2+ , AsO 2 - e PQT não observamos diferenças em relação a linhagem controle, sugerindo que no prévio condicionamento ao estresse, VNG_RS05855 não participe nas respostas adaptativas. De acordo com análises do transcritoma, a ausência do gene VNG_RS05855 afetou a expressão de 117 genes, 44% deles sem função conhecida. Entre os que se conhece a função se destacam os transcritos relacionados às vesículas de gás e transporte. Na produção das vesículas de gás, as análises da cobertura de reads sugerem que a participação de VNG_RS05855 esteja relacionada a regulação antisense. A expressão de genes relacionados ao transporte nos indica que o metabolismo do RNA é complexo e o impacto do VNG_RS05855 na regulação pós-transcricional, heterogêneo. Dentre os transportadores com expressão afetada estão os relacionados às respostas a arsênico, sugerindo o seu papel na resposta adaptativa frente a este metalóide. A análise de sítios de processamento utilizando dados de transcritoma (TPS-transcriptional processing sites) indica a influência diferencial no processamento dos transcritos dos replicons de H. salinarum NRC-1, com VNG_RS05855 atuando menos nos transcritos derivados do cromossomo que nos dos megaplasmídeos. Além disso, observamos o processamento preferencial de transcritos longos, apoiando a expressão diferencial de transcritos dentro de unidades policistrônicas. A estruturação dos RNAs poderia contribuir para sinalizar o grau de processamento promovido por VNG_RS05855. A obtenção da proteína heteróloga e os testes de atividade mostraram com clareza o papel ribonucleolítico in vitro do VNG_RS05855, tornando-se o primeiro retrato deste tipo de atividade em proteínas metalo-β-lactamases que carecem de domínio exosite na classe Halobacteria.
Título em inglês
Post-transcriptional regulation in Halobacterium salinarum NRC-1: characterization of VNG_RS05855 gene
Palavras-chave em inglês
asRNA
Bioinformatics
Halobacterium salinarum NRC-1
In vitro assays
Metallo-β-lactamases
Phenotypic assays
Post-transcriptional regulation
RNA-seq
RNases
VNG_RS05855
Resumo em inglês
The family of metallo-β-lactamase enzymes comprises a group of diverse proteins, some of them with participation in nucleic acid metabolism. In prokaryotic genomes many proteins are annotated as potential metallo-β-lactamases, but without proven function. This is the case of gene VNG_RS05855 from Halobacterium salinarum NRC-1, an organism in which the main actors of post-transcriptional regulation, the RNases, are still poorly characterized. In this research, we report the first characterization of the metallo-β-lactamase VNG_RS05855 in the context of post-transcriptional regulation of H. salinarum NRC-1 halophilic archaeon by integrating experimental and computational approaches. VNG_RS05855 has sequence similarity to proteins described with ribonuclease activity, but the absence of specific domains (exosite) casts doubt of this possible function. VNG_RS05855 presents constitutive expression during growth and environmental and genetic perturbations its expression levels correlates with other RNases, as observed in other organisms. Although the absence of the VNG_RS05855 gene did not affect either the viability and growth of the knockout strain, we observed slight phenotypic differences under low concentrations of transition metals (Zn2+ , Cu2+ , Fe2+ , Mn2+ , Co2+ ), a metalloid (AsO2-), an oxidizing agent (H 2 O 2 ) and salt variations of the culture medium. Differences were also observed in the pH of the growth media before the metabolic transitions promoted by changes in nutrient availability and light. The results suggest the participation of VNG_RS05855 in adaptive responses to small environmental changes. The phenotypes were observed in the final stages of growth where other factors could also be related to the observed differences, such as gas vesicle release and bacteriorhodopsin production. However, our experiments showed that these factors do not affect the observed phenotype. Nevertheless, when analyzing the survival of the knockout strain in semi-lethal concentrations of Cu2+ , AsO2 and PQT, we noticed that there were no differences regarding the control strain, suggesting that in the previous stress conditioning, VNG_RS05855 does not participate in the adaptive responses. According to transcriptome analysis, the absence of the VNG_RS05855 affected the expression of 117 genes, 44% of them with unknown function. Among the genes with assigned function, we found transcripts related to gas vesicles and transport. In the production of gas vesicles, analysis of reads coverage suggests that the participation of VNG_RS05855 is related to antisense regulation. The expression of transport-related genes lead us to suggest that RNA metabolism is complex and the impact of VNG_RS05855 on post-transcriptional regulation is heterogeneous. Among the differentially expressed transporters we found genes related to arsenic response, suggesting the role of VNG_RS05855 in the adaptive response to this metalloid. Analysis of transcriptional processing sites (TPS) showed differential influence on the processing of H. salinarum NRC-1 replicons, a smaller density of TPS was found on chromosome-derived transcripts than on megaplasmids. In addition, we observed the preferential processing of long transcripts, supporting the differential expression of transcripts within polycistronic units. RNA secondary structure could contribute to indicate the degree of processing promoted by the activity of VNG_RS05855. We were able to express the the heterologous protein of this gene and test its activity. The results clearly show its in vitro ribonucleolytic role, showing for the first time of this kind of activity in metallo-β-lactamase protein lacking exosite domain in Halobacteria class.
 
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Data de Publicação
2019-12-03
 
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