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Mémoire de Maîtrise
DOI
10.11606/D.91.2007.tde-04032008-150358
Document
Auteur
Nom complet
Luciana Chaves Ferreira
Adresse Mail
Unité de l'USP
Domain de Connaissance
Date de Soutenance
Editeur
Piracicaba, 2007
Directeur
Jury
Mui, Tsai Siu (Président)
Lacava, Paulo Teixeira
Stenico, Maria Estela
Titre en portugais
Aspectos bioquímicos e moleculares de bactérias isoladas de Terra Preta Antropogênica (TPA) na região da Amazônia Brasileira
Mots-clés en portugais
Bioquímica do solo
DNA
Ecologia microbiana
Microbiologia do solo
Peptídeos
Sítio arqueológico - Amazônia Brasileira.
Resumé en portugais
A Terra Preta Antropogênica (TPA) ocorre somente em sítios arqueológicos na região amazônica. Estes solos de origem antrópica foram enriquecidos em nutrientes, provavelmente pelo manejo de restos orgânicos e do fogo pelas populações pré-colombianas. Em TPA, a presença de material orgânico estável e a grande atividade biológica indicam que este tipo de solo pode ser um local de alta diversidade microbiana, constituindo numa fonte de germoplasma microbiano. Contudo, atualmente não se tem conhecimento da biologia e, sobretudo da estrutura e diversidade das comunidades microbianas deste solo. O conhecimento sobre a diversidade microbiana trará compreensão das funções exercidas pelas comunidades microbianas no solo e o conhecimento das suas interações com outros componentes da biodiversidade, além de benefícios econômicos e estratégicos, como a descoberta de microrganismos potencialmente exploráveis nos processos biotecnológicos. Metabólitos secundários, como antibióticos e toxinas microbianas, podem ser considerados como produtos naturais de importância ecológica. Muitos metabólitos secundários produzidos por fungos e bactérias desenvolvem atividades multifuncionais através da via não-ribossomal, pelas enzimas peptídeo sintetase e policetídeo sintase, que são enzimas multidomínio e podem estar envolvidas na produção de sideróforos e antibióticos. Este estudo teve como objetivo a busca por peptídeos não-ribossômicos produzidos por bactérias isoladas de TPA e suas caracterizações bioquímica e molecular. Através de cultivo, 150 isolados foram selecionados de TPA para análise taxonômica por amplificação e seqüenciamento do gene 16S rRNA, após análise de restrição por enzima de restrição para se conhecer o polimorfismo genético dos isolados. De acordo com o seqüenciamento pôde-se agrupar esses isolados em 17 grupos. Os resultados indicaram a presença dos gêneros Pseudomonas, Bacillus, Arthrobacter, Janthinobacterium, Staphylococcus e Massili. Metabólitos extracelulares foram extraídos dos cultivos bacterianos, usando acetato de etila e clorofórmio, seguidos pela concentração dos extratos, para determinação da capacidade antimicrobiana e a produção de sideróforo foi avaliada usando-se cromoazurol S (CAS). Os resultados mostraram que treze dos 17 isolados apresentaram genes NRPS ou PKS, ou para ambos os genes, associados à produção de peptídeos não-ribossômicos. De todos os isolados estudados, 97% apresentaram produção de sideróforos e algumas espécies dos gêneros Bacillus, Pseudomonas, Arthrobacter e Janthinobacterium mostraram positivas em inibir o crescimento de cinco bactérias testes. A produção de sideróforos do tipo hidroxamato foi positiva para 8 isolados e 7 isolados para o tipo catecol, sendo que 2 isolados não apresentaram reação. Os resultados obtidos em espectrometria de massas Q-TOF indicaram a presença do antibiótico fenazina para o isolado Pseudomonas putida BCM 20, considerado de importância no controle biológico de diversas bactérias patogênicas.
Titre en anglais
Biochemical and molecular aspects of microorganisms from Anthropogenic Dark Earth (ADE) in the Brazilian Amazon
Mots-clés en anglais
Bacterial community
Bioactive composites
Dark earth
DNA sequencing
Phenazin.
Siderophores
Resumé en anglais
The Anthropogenic Dark Earth (ADE) occurs mainly in archeological sites in the Amazon region. These soils from anthropic origin were enriched with nutrients, probably by the management of organic residues and fire produced by pre-Colombian populations. In ADE, the presence of stable organic matter and high biological activity indicate that this type of soil can be a site of a highly microbial diversity, appointing as a source of microbial germplasm. However, at the present time there is little knowledge about its biology, and especially the structure and diversity of the microbial communities from these soils. The knowledge about microbial diversity will promote a better understanding of the function promoted by the soil microbial community and the knowledge of its interaction with components from biodiversity, likewise the economical and strategic benefits, as for example the discovery of potential microorganisms for exploring biotechnological processes. Secondary metabolites, like antibiotics and microbial toxins, may be considered as natural products of ecological importance. Many of the secondary metabolites produced by fungi and bacteria develop multifunctional activities via non-ribosomal for peptide enzymes and polypeptide synthesis, that are multi-domain enzymes and can be involved in the production of siderophore and antibiotics. This study had the objective of searching for non-ribosomal peptides produced by bacteria isolated from ADE and its biochemical and molecular characterization. Through cultivation in selective media, 150 strains were isolated from ADE for taxonomic analysis by amplification and sequencing of the 16S rRNA gene, after the restriction analysis by restriction enzyme for knowing the genetic strains polymorphism. From the sequencing, it was possible to select these strains in 17 groups, with predominant genera - Pseudomonas, Bacillus, Arthrobacter, Janthinobacterium, Staphylococcus and Massili. Extracellular metabolites were extracted from the cultivated bacteria, using ethylacetate and chloroform, followed by detection of antimicrobial metabolites from bacterial supernatants. Siderophore production was evaluated using ChromoBlue S (CAS). The results from the strains representing the 17 groups showed that at least thirteen strains presented NRPS or PKS gene, or for both genes, associated to the production of non-ribosomal peptides. From all the studied strains, it was found that 97% presented the production of siderophore and that several species from the genera Bacillus, Pseudomonas, Arthrobacter and Janthinobacterium proved to be positive on bacterial growth inhibition. The production of hydroxamate-type siderophore was positive to eight strains and seven strains for the cathecol type, and two strains did not present any reaction. The results obtained from the Q-TOF mass spectrometry confirmed the production of 6-hydroxyphenazine-1-carboxylic acid from the isolated identified as Pseudomonas putida BCM 20. This compound belongs to a fully studied group of antibiotics for biological control against several pathogenic bacteria.
 
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lucianachaves.pdf (3.25 Mbytes)
Date de Publication
2008-04-01
 
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