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Thèse de Doctorat
DOI
https://doi.org/10.11606/T.9.2020.tde-25062021-172307
Document
Auteur
Nom complet
Kazumi Kinoshita Teramoto
Unité de l'USP
Domain de Connaissance
Date de Soutenance
Editeur
São Paulo, 2020
Directeur
Jury
Pinto Junior, Ernani (Président)
Carvalho, Joao Carlos Monteiro de
Genuario, Diego Bonaldo
Kummrow, Fábio
Titre en portugais
Isolamento e caracterização de cianopeptídeos produzidos por Microcystis aeruginosa e avaliação de toxicidade em embriões de Danio rerio
Mots-clés en portugais
Cianobactérias
Microciclamida
Microginina
Zebrafish
Resumé en portugais
Cianobactérias do gênero Microcystis são consideradas cosmopolitas e são as mais recorrentes em florações, sendo frequentemente associadas às hepatotoxinas microcistinas. Além das conhecidas toxinas, as cianobactérias produzem uma vasta gama de metabólitos secundários com um amplo repertório de atividades bioativas. A co-ocorrência de cianotoxinas e outros cianopeptídeos em concentrações semelhantes durante eventos de floração de cianobactérias é bastante comum e nem sempre os efeitos negativos são limitados às toxinas produzidas, o que torna. indispensável a caracterização e a investigação da toxicidade desses outros compostos de forma individual. O objetivo do trabalho foi identificar e isolar cianopeptídeos produzidos por M. aeruginosa LTPNA 08, caracterizá-los estruturalmente por RMN e LC-HR-QTOF-MS/MS e avaliar sua toxicidade aguda em embriões de D. rerio. Foram isolados dois cianopeptídeos, a MG 770, reportada em trabalhos anteriores, e um composto desconhecido de 582 Da, que foram caracterizados por RMN e LC-HR-QTOF-MS/MS. Os dados espectroscópicos obtidos, comparados com dados da literatura, revelaram que a MG 770 apresenta a mesma estrutura molecular da MG 478 e o composto de 582 Da foi confirmado como sendo uma microciclamida, reportados por Ishida et al. (2000 a, b), respectivamente. Os dados de RMN comparativos identificaram a microciclamida (A) e a microciclamida GL582, ambos reportados por Raveh et al. (2010) como possíveis estruturas do composto de 582 Da. O efeito tóxico dos cianopeptídeos isolados foi avaliado por meio do ensaio FET com embriões de D. rerio. A microciclamida (583 Da) causou letalidade em 62% dos animais, após 96 h de exposição na concentração de 50 µg.mL-1, com evidências de cardiotoxicidade (edemas cardíacos). O valor de CL50 calculado para a microciclamida foi de 42,98 (37,79-48,89) µg. mL-1. A MG 770, por outro lado, não apresentou efeitos tóxicos ou teratogênicos, após 96 hpf, em nenhuma das concentrações testadas e por isso a sua CL50 não pode ser calculada. Ambos os compostos foram considerados de baixa toxicidade. Extratos brutos aquoso (EBA) e metanólico (EBM) de LTPNA 08 também foram avaliados por 96 h e mostraram alta taxa de letalidade na concentração de 1 mg. mL-1. Os valores de CL50 obtidos para o EBA e o EBM foram de 0,25 (0,15-0,27) e 0.46 (0,40-0,52) mg. mL-1, respectivamente. Não foram observados efeitos teratogênicos em nenhum dos extratos e o efeito cardiotóxico foi observado apenas no EBM na concentração de 1 mg. mL. O método de triagem desenvolvido para a detecção de microgininas por LC-QqQ-MS/MS em modo precursor ion scan identificou compostos suspeitos em 11 amostras de cianobactérias. A confirmação dos compostos foi feita por LC-HR-QTOF-MS/MS, que identificou a presença das microgininas em 7 das 9 amostras de cianobactérias isoladas e em 2, no amostras ambientais. Foram identificadas no total, 19 variantes de MG, das quais 11 já foram descritas na literatura e as demais foram tentativamente caracterizadas através da comparação dos espectros de fragmentação de MG conhecidas. O método de precursor ion scan se mostrou rápido e sensível na busca por espécies produtoras de microgininas e triagem desses compostos em amostras de biomassa de cianobactérias. Os cianopeptídeos estudados neste trabalho apresentaram baixa toxicidade aguda em D. rerio.
Titre en anglais
Isolation and characterization of cyanopeptides produced by Microcystis aeruginosa and toxicity evaluation in Danio rerio embryos
Mots-clés en anglais
Cyanobacteria
Microcyclamide
Microginins
Zebrafish
Resumé en anglais
Microcystis is a common bloom forming cyanobacterial genus which has a cosmopolitan distribution and frequently associated with the hepatotoxins microcystin. Beyond the well-known cyanotoxins, cyanobacteria produce a wide range of biologically active secondary metabolites. The co-occurrence of cyanotoxins and other cyanopeptides at similar concentrations during cyanobacterial blooms events is common and the negative effects are not always limited to the toxins produced, which makes it essential to investigate and characterize the toxicity of these other compounds individually. The aim of this work was to identify and isolate cyanopeptides produced by M. aeruginosa LTPNA 08, characterize them structurally by NMR and LC-HR-QTOF-MS / MS and evaluate their acute toxicity in D. rerio embryos. Two cyanopeptides, MG 770 and an unknown compound of 582 Da, were isolated and characterized by NMR and LC-HR-QTOF-MS/MS. The spectroscopic data obtained, compared with data from the literature, revealed that MG 770 has the same molecular structure as MG 478 and the 582 Da compound was confirmed to be a microcyclamide, previously reported by Ishida et al. (2000 a, b), respectively. Comparative NMR data identified microcyclamide (A) and microcyclamide GL582, both reported by Raveh et al. (2010), as possible structures of the 582 Da compound. The toxic effect of the isolated cyanopeptides was evaluated using D. rerio embryos (FET assay). Microcyclamide (583 Da) caused lethality in 62% of the animals, after 96 h of exposure to 50 µg.mL-1, with evidence of cardiotoxicity (pericardiac edema). The LC50 value calculated for microcyclamide was 42.98 (37.79-48.89) µg. mL-1. MG 770, on the other hand, had no toxic or teratogenic effects, after 96 hpf, in any of the tested concentrations and LC50 cannot be calculated. Both compounds were considered to be of low toxicity. Crude aqueous (EBA) and methanolic (EBM) extracts of LTPNA 08 were also evaluated for 96 h and showed a high lethality rate at a concentration of 1 mg. mL-1. The LC50 values obtained for EBA and EBM were 0.25 (0.15-0.27) and 0.46 (0.40-0.52) mg. mL-1, respectively. No teratogenic effects were observed in any of the extracts and the cardiotoxic effect was observed only in EBM at a concentration of 1 mg. mL-1. The screening method developed for the detection of microginins by LC-QqQ-MS/MS on precursor ion scan mode identified suspicious compounds in 11 samples. Microginins confirmation was performed by LC-HR-QTOF-MS/MS, which identified the presence in 7 of the 9 isolated cyanobacteria samples and in 2 environmental samples. In total, 19 MG variants were identified, of which 11 have already been described in the literature and the remaining have been tentatively characterized by comparing fragmentation spectra of known MG. The precursor ion scan method was shown to be fast and sensitive in the search for microginins producing species and screening these compounds in samples of cyanobacteria biomass. The cyanopeptides studied in this work showed low acute toxicity in D. rerio.
 
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Date de Publication
2021-07-26
 
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