Tese de Doutorado

Atualmente, observamos amplamente casos de resistência aos antimaláricos empregados no tratamento primário contra a malária, em diferentes continentes. A problemática da resistência dos parasitas a esses medicamentos impulsiona esforços globais na busca por antimaláricos. Nesse contexto, a identificação de novos fármacos com potencial ação inibitória sobre o desenvolvimento do Plasmodium surge como um elemento-chave para desvendar os mecanismos de sobrevivência e resistência do parasita, contribuindo significativamente para o avanço das terapias antimaláricas. Nesse sentido, nosso projeto avaliou duas bibliotecas de compostos, a biblioteca TCAMS (48 compostos) e uma biblioteca de compostos sintéticos derivados do 1H e 2H-1,2,3-triazol (54 compostos). Com a triagem da biblioteca TCAMS identificando 5 compostos antimaláricos com valores de IC₅₀ inferiores a 50nM. A avaliação da citotoxicidade em células HEK293, bem como uma possível elucidação dos alvos hipotéticos para este grupo de compostos podem contribuir para futura investigações. Para a biblioteca de triazóis identificamos 34 compostos com potencial atividade antimalárica em concentrações na ordem de µM. Os valores de IC₅₀ variam de 2,80µM a 29,27µM. Também avaliamos a citotoxicidade dos compostos mais promissores em células HEK293, em ensaios de MTT. Estes ensaios demonstraram que os compostos não possuem toxicidade nas concentrações testadas. A seguir selecionamos alguns destes compostos de ambas as bibliotecas para realizar os mesmos ensaios com a cepa PfSR25^- (nocaute para o receptor de P. falciparum, SR25). Nossos experimentos com a cepa PfSR25^- demonstraram que tanto os compostos triazólicos com maior atividade antimalárica para a cepa Pf3D7, bem como os de menor atividade, resultaram em valores de IC₅₀ significativamente menores para a cepa nocaute. Já os compostos TCAMS não apresentaram nenhuma diferença entre as cepas. Avaliamos a susceptibilidade da cepa PfSR25^- em comparação com a cepa Pf3D7 frente aos antimaláricos clássicos: atovaquona, cloroquina, artemisinina, diidroartemisinina, lumefantrina, mefloquina, piperaquina, primaquina e pirimetamina. Nossos resultados com a cepa PfSR25^- demonstram que os antimaláricos lumefantrina e piperaquina, apresentam uma redução do valor de IC₅₀ de 58% e 44% respectivamente quando comparado à cepa Pf3D7. Empregamos nossa abordagem de avaliação de compostos comparativa utilizando a cepa PfSR25^- e Pf3D7 em compostos selecionados da biblioteca MMV (Malaria-Box) que atuam no egresso/invasão do eritrócito (MMV006429, MMV396715, MMV019127, MMV665874, MMV665878, MMV665785 e MMV665831) entretanto, não identificamos diferenças entre as cepas, exceto para o composto MMV665831, que usamos para investigar o mecanismo de entrada de cálcio operado por armazenamento (SOCE). Nenhuma diferença significativa foi observada no mecanismo SOCE tanto com relação ao tratamento com MMV665831 ou quanto a comparação entre as cepas PfSR25^- e Pf3D7. Nossas análises de RT-qPCR revelou que o tratamento de parasitas com lumefantrina e a piperaquina são capazes de reduzir a expressão de pfsr25 na fase de anel quando incubado com antimalárico 100nM por 24h. Também observamos uma redução na expressão genica da cepa nocaute PfSR25^- relativa à cepa selvagem Pf3D7 para os genes que codificam as proteínas PfMDR1, PfCDPK1 e PfPKB na fase de esquizonte. Nossa mineração de dados buscando por genes correlatos ao K⁺ no genoma do parasita identificou 12 genes, dentre eles observamos que a cepa nocaute apresenta uma expressão genica diferencial em relação a Pf3D7 para os genes que codificam os canais de potássio PfK1 e PfK2, dependendo do estágio eritrocítico. Na tentativa de confirmar dados anteriores do laboratório em que a Dra. Miriam S. Moraes descobriu que o anticorpo contra PfSR25, utilizado em seu artigo (Moraes et al., 2017) é uma ferramenta promissora para o desenvolvimento de antimaláricos (Moraes et al., dados não publicados), reproduzimos seus experimentos, e utilizamos aqui um novo anticorpo pAbPfSR25, NNKKSETSDINDDL. Quando parasitas Pf3D7 foram tratados com 50µg/ml do pAbPfSR25 observamos uma inibição significativa (44,89%) do desenvolvimento eritrocitário. Nossos resultados se somaram os dados anteriores do laboratório contribuindo para o entendimento do papel do receptor serpentino 25 do P. falciparum.

Currently, we observe widespread cases of resistance to antimalarials employed in the primary treatment against malaria on different continents. The issue of parasite resistance to these drugs propels global efforts in the search for antimalarials. In this context, the identification of new drugs with potential inhibitory action on the development of Plasmodium emerges as a key element in unraveling the parasite′s survival and resistance mechanisms, contributing significantly to the advancement of antimalarial therapies. Within this context, our project evaluated two compound libraries, the TCAMS library (48 compounds), and a library of synthetic compounds derived from 1H and 2H-1,2,3-triazole (54 compounds). Screening of the TCAMS library identified 5 antimalarial compounds with IC₅₀ values below 50nM. The evaluation of cytotoxicity in HEK293 cells, as well as a potential elucidation of the hypothetical targets for this compound group, could expedite future research steps. For the triazole library, we identified 34 compounds with potential antimalarial activity at concentrations in the order of µM. The IC₅₀ values ranged from 2.80µM to 29.27µM. We also evaluated the cytotoxicity of the most promising compounds on HEK 293 cells in MTT assays. These demonstrated that the compounds were not toxic at the tested concentrations. Next, we selected some of these compounds from both libraries to conduct the same tests with the PfSR25^- strain (knockout for the P. falciparum receptor, SR25). Our experiments with the PfSR25^- strain showed that both the triazole compounds with the highest antimalarial activity for the Pf3D7 strain, as well as those with the lowest activity, resulted in significantly lower IC₅₀ values for the knockout strain. In contrast, TCAMS compounds showed no difference between the strains. We assessed the susceptibility of the PfSR25^- strain compared to the Pf3D7 strain against classic antimalarials: atovaquone, chloroquine, artemisinin, dihydroartemisinin, lumefantrine, mefloquine, piperaquine, primaquine, and pyrimethamine. Our results with the PfSR25^- strain demonstrate that the antimalarials lumefantrine and piperaquine show a reduction in IC₅₀ value of 58% and 44%, respectively, when compared to the Pf3D7 strain. We applied our comparative compound evaluation approach using the PfSR25^- and Pf3D7-strains on selected compounds from the MMV (Malaria-Box) library that act on erythrocyte egress/invasion (MMV006429, MMV396715, MMV019127, MMV665874, MMV665878, MMV665785, and MMV665831); however, we did not identify any differences between the strains, except for compound MMV665831, which we used to investigate the storage-operated calcium entry (SOCE) mechanism. No significant difference was observed in the SOCE mechanism either concerning treatment with MMV665831 or when comparing the PfSR25^- and Pf3D7 strains. Our RT-qPCR analyses revealed that lumefantrine and piperaquine are capable of reducing the expression of pfsr25 in the ring phase when incubated with 100nM antimalarial for 24h. We also observed a reduction in the gene expression of the PfSR25^- knockout strain relative to the wild-type Pf3D7 strain for the genes encoding the proteins PfMDR1, PfCDPK1, and PfPKB in the schizont phase. Our data mining search for K⁺-related genes in the parasite′s genome identified 12 genes, among which we observed that the knockout strain shows differential gene expression compared to Pf3D7 for the genes encoding the potassium channels PfK1 and PfK2, depending on the erythrocytic stage. In an attempt to confirm previous data from the laboratory where Dr Miriam S. Moraes discovered that the antibody against PfSR25 used in her paper (Moraes et al., 2017) was a promising tool for antimalarial development (Moraes et al, unpublished data), we reproduced her experiments and here used a new pAbPfSR25 antibody, NNKKSETSDINDDL. When Pf3D7 parasites were treated with 50µg/ml of pAbPfSR25, we observed a significant inhibition (44.89%) of erythrocyte development. Our results complement previous data from the laboratory and contribute to our understanding of the role of the P. falciparum serpentine receptor 25.