A hemoglobina glicada (HbA1c) é o principal marcador de controle glicêmico de longo prazo usado clinicamente no mundo, e seus valores estão diretamente associados à quantidade de glicose disponível na corrente sanguínea. Atualmente existem diversos métodos disponíveis para esta determinação, porém estes em menor ou maior grau possuem limitações, principalmente quando na presença de hemoglobinas variantes. Devido à sua alta especificidade, a espectrometria de massas tem alto potencial para reduzir as interferências apresentadas por outros ensaios na avaliação de marcadores sanguíneos. A aquisição independente de dados é um dos modos de aquisição da espectrometria de massas em tandem que permite uma cobertura abrangente do proteoma e tem o potencial de funcionar como um protocolo unificado para determinar uma infinidade de proteínas no sangue. Neste estudo, combinamos a aquisição independente de dados com microamostragem volumétrica absortiva e processamento de amostra proteômica automatizada como uma plataforma para realizar a determinação de marcadores clínicos. Avaliamos, como prova de conceito, dois biomarcadores clínicos relacionados à hemoglobina: hemoglobina glicada (HbA1c) e variantes de hemoglobina (Hbvar). Alcançamos o processamento da amostra em menos de 6 horas e a análise de espectrometria de massa otimizada exigiu 30 minutos. HbA1c por DIA mostrou boa correlação com o método de referência, mas a imprecisão do método não atendeu à especificação de imprecisão muito baixa para a avaliação clínica deste biomarcador. Uma estratégia para identificação de Hbvar foi desenvolvida com base em um banco de dados customizado combinado com um fluxo de trabalho para extração de dados DIA e avaliação rigorosa de peptídeos. Esta abordagem revelou Hbvars não identificados por métodos rotineiramente clínicos, como Hb Woodville e Hb Okayama. Usar o VAMS com um método de aquisição abrangente pode permitir a determinação de vários marcadores clínicos. Como poucas metodologias demonstraram aplicabilidade clínica do DIA, os resultados quantitativos e qualitativos apresentados aqui fornecem informações adicionais sobre sua força e deficiências para a rotina clínica. Os dados DIA estão disponíveis através do repositório Panorama via https://panoramaweb.org/x5nqYH.url (identificador do ProteomeXchange PXD029918).

Glycated hemoglobin (HbA1c) is the main marker of long-term glycemic control used clinically and its values are directly associated with the amount of glucose available in the bloodstream. There are currently several methods available for this determination, but these to a lesser or greater extent have limitations, especially when in the presence of variant hemoglobins. Because of its high specificity, mass spectrometry has a high potential to reduce the interferences presented by other assays in the evaluation of blood markers. Data-independent acquisition (DIA) is one of the acquisition modes of tandem mass spectrometry that allows comprehensive proteome coverage, and it has the potential to work as a unified protocol to determine the multitude of proteins in blood. Here, we combined DIA with volumetric absorptive microsampling and automated proteomics sample processing as a platform to perform clinical markers determination. We evaluate, as a proof-of-concept, two hemoglobin-related clinical biomarkers: glycated hemoglobin (HbA1c) and hemoglobin variants (Hbvar). We achieved sample processing in less than 4 hours and optimized mass spectrometric analysis required 30 minutes. HbA1c by DIA showed good correlation with the reference method, but method imprecision did not meet the very low imprecision specification for the clinical evaluation of this biomarker. A strategy for Hbvar identification was developed based on a customized database combined with a workflow for DIA data extraction and rigorous evaluation of peptides. This approach revealed Hbvars not identified by routinely clinical methods such as Hb Woodville and Hb Okayama. Using VAMS with a comprehensive acquisition method could enable the determination of multiple clinical markers. As few methodologies have demonstrated clinical applicability of DIA, quantitative and qualitative results presented here provides additional information about its strength and deficiencies for clinical routine. DIA data are available through the Panorama repository via https://panoramaweb.org/x5nqYH.url (ProteomeXchange identifier PXD029918).