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Thèse de Doctorat
DOI
10.11606/T.9.2005.tde-31012006-091917
Document
Auteur
Nom complet
Edward José de Oliveira
Adresse Mail
Unité de l'USP
Domain de Connaissance
Date de Soutenance
Editeur
São Paulo, 2005
Directeur
Jury
Kanamura, Hermínia Yohko (Président)
Hirata, Mário Hiroyuki
Pinto, Pedro Luiz Silva
Souza, Doralice de
Valli, Luiz Carlos Pedrosa
Titre en portugais
Desenvolvimento de um método sorológico para o diagnóstico laboratorial da esquistossomose mansoni baseado em peptídeos sintéticos
Mots-clés en portugais
Imunodiagnóstico
Peptídeo sintético
Teste imunoenzimático de ELISA
Resumé en portugais
Baseado nos algoritmos de hidrofilicidade e flexibilidade obtidos pelo uso do "software" ProtScale, acessível no endereço http://au.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl, foram selecionados sete peptídeos, potencialmente antigênicos, das proteínas de Schistosoma mansoni, entre elas, catepsina B (Sm 31), "heat shock protein" de 70 kDa (HSPSm-70), "cathodic circulating antigen" (CCA), e uma seqüência da fase de leitura aberta do clone ET03. Estes peptídeos, produzidos por síntese química, foram denominados P1, P2, P3, P4, P5, P6 e P7. Em seguida, os peptídeos foram testados isoladamente contra "pool" de soros humanos positivos e negativos. Após vários testes, os peptídeos P1, P2, P3, P6 e P7, que apresentaram imunorreatividade quando ensaiados por método imunoenzimático, foram usados na padronização de um método imunoenzimático de ELISA, utilizando placas Costar 3590, que passou a ser denominado ELISA-Peptídeo (ELISA-Pp). Este método foi avaliado empregando-se 192 amostras de soro, divididas em quatro grupos: (A) 23 amostras de soro, coletadas de pacientes residentes no Nordeste do Brasil, portadores de esquistossomose aguda, com ovos de S. mansoni nas fezes; (B) 30 amostras de soro, coletadas de pacientes residentes no Norte do Brasil, portadores de esquistossomose crônica, com ovos de S. mansoni nas fezes; (C) 39 amostras de soro, coletadas de indivíduos residentes no Norte do Brasil, portadores de outras parasitoses, mas não esquistossomose; (D) 100 amostras de soro, coletadas de indivíduos residentes em Campinas-SP, negativos pelo exame coproparasitológico. Os resultados obtidos foram analisados comparativamente com os encontrados por outras metodologias imunodiagnósticas: reação de imunofluorescência indireta para detecção de anticorpos IgM contra tubo digestivo de verme (RIF-IgM), método imunoenzimático para detecção de anticorpos IgM contra antígenos polissacarídeos (ELISA-IgM) ou anticorpos IgG contra extrato total de vermes (ELISA-IgG). A sensibilidade do ELISA-Pp foi de 86,6%, quando avaliado frente a soros de pacientes que apresentaram ovos de S. mansoni nas fezes e de 79,3%, considerando como esquistossomótico aqueles pacientes com sorologia positiva pelos métodos de RIFI-IgM e ELISA-IgM. A especificidade do ELISA-Pp foi de 94,2% e 94,7%, respectivamente, considerando como grupo controle, não esquistossomótico, indivíduos com resultado de exame parasitológico de fezes negativo para ovos de S. mansoni ou indivíduos com sorologia negativa pelo ELISA-IgM e RIFI-IgM. O valor preditivo positivo apresentado pelo ELISA-Pp foi de 85,2% enquanto para os outros métodos sorológicos variou de 63,4% a 78,6%. O valor preditivo negativo do ELISA-Pp foi em média 3% inferior aos obtidos pelos outros métodos sorológicos. Comparando-se os resultados obtidos pelo ELISA-Pp com os dos outros métodos sorológicos, melhor concordância foi demonstrada com os resultados do ELISA-IgM (Índice Kappa=0,75). Os índices de reatividade para detecção de anticorpos IgG e IgM foram significantemente maiores (P < 0,05) nos pacientes com esquistossomose aguda (grupo A) do que crônica (grupo B). No presente estudo, ELISA-Pp demonstrou bom desempenho (eficácia diagnóstica = 81,0%), entretanto novos estudos são necessários para avaliação de sua aplicabilidade em inquéritos soroepidemiológicos.
Titre en anglais
Development of a serologic method for laboratory diagnosis of the schistosomiasis mansoni based on synthetic peptides
Mots-clés en anglais
Immunoenzimatic assay of ELISA
Imunodiagnosis
Synthetic peptide
Resumé en anglais
Based on algorithms of hidrophilicity and flexibility, obtained by the use of the ProtScale software, disposable at the site http://au.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl, seven potentially antigenic peptides were selected from different Schistosoma mansoni proteins: cathepsin B (Sm31), heat shock protein (SmHSP-70), cathodic circulating antigen (CCA) and the polypeptidic sequence of the open reading frame (ORF) of the ET-03 clone. The peptides were produced by chemical synthesis and denominated as P1, P2, P3, P4, P5, P6 and P7. These were independently tested against two pools of human sera, one positive and one negative for schistosomiasis. The peptides P1, P2, P3, P6 and P7, that presented better reactivity when assayed by an immunoenzymatic method, were chosen to be used as antigen for the standardization of an ELISA method, by utilizing Costar 3590 micro plates, and it was called Peptide-ELISA (Pp-ELISA). This method was evaluated on 192 serum samples, divided in four groups: (A) 23 samples from patients with acute schistosomiasis and positive for S. mansoni eggs in fecal examination, who were living in a Brazilian Northeast state; (B) 30 samples from patients with chronic schistosomiasis and positive for S. mansoni eggs, who were living in a Brazilian North state; (C) 39 samples from individuals with other parasite infection, but no schistosomiasis, living in a Brazilian North state; (D) 100 samples from clinically healthy individuals who presented negative results for coproparasitologic method, living in Campinas, São Paulo State. The serological data obtained by Pp-ELISA were comparatively analyzed with the results obtained by other immunodiagnostic methods: immunofluorescence test for detection of IgM antibodies against gut associated antigens (IgM-IFT); ELISA for detection of IgM antibodies against gut associated polysaccharide antigens (IgM-ELISA) or for detection of IgG antibodies against worm crude antigens (IgG-ELISA). The sensitivity of Pp-ELISA was of 86,6%, considering as schistossomiasis patients only the ones who presented S. mansoni eggs in stool examination, and 79,3%, when a serological criterion was used for definition of schistosomiaisis patients, with positive results for both IgM-IFT and IgM-ELISA. The specificity of the Pp-ELISA was respectively 94,2% or 94,7%, considering as control group, without schistosomiasis, S. mansoni egg negative individuals in stool examination or serologically negative individuals by both tests, IgM-IFT and IgM-ELISA. The positive predictive value for Pp-ELISA was 85,2%, while for the other serologic methods varied from 63,4% to 78,6%. The negative predictive value for Pp-ELISA was as a rule 3% lower than the indices obtained for other serologic methods. When the results of Pp-ELISA were compared with the ones obtained by other serologic methods, better concordance was demonstrated with IgM-ELISA (Kappa indice = 0,75). The reactivity indices for detection of IgG and IgM antibodies were significantly higher (P < 0,05) in acute (group A) than chronic schistosomiasis patients (group B). In this study the Pp-ELISA presented a good performance (Diagnostic efficacy = 81,0%), however further studies must be necessary for evaluation of its applicability on seroepidemiologic surveys.
 
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Tese_Edward.pdf (474.52 Kbytes)
Date de Publication
2007-02-02
 
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