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Tese de Doutorado
DOI
https://doi.org/10.11606/T.9.2003.tde-25082022-091347
Documento
Autor
Nome completo
Maria Márcia Imenes Ishida
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Paulo, 2003
Orientador
Banca examinadora
Vaz, Adelaide Jose (Presidente)
Chieffi, Pedro Paulo
Cunha, Regina Ayr Florio da
Livramento, José Antonio
Takei, Kioko
Título em português
Aplicação de testes imunoenzimáticos (ELISA e Immunoblot) para o diagnóstico da cisticercose em amostras séricas humanas de diferentes grupos de população do estado de Santa Catarina e perfil de reatividade homóloga e heteróloga de antígenos de Taenia sp e de outros agentes parasitários antigenicamente relacionados
Palavras-chave em português
Antígenos
Cisticercose (Diagnóstico)
Testes imunológicos
Resumo em português
A neurocisticercose (NC), doença causada pela larva de Taenia solium alojada no SNC, caracteriza-se pela gravidade dos sintomas e elevada letalidade. É a mais freqüente dentre as manifestações neuroparasitárias e acredita-se ser uma das principais causas de epilepsia nos países em desenvolvimento, incluindo o Brasil. A heterogeneidade da resposta imune humoral nas diferentes fases da doença resulta em variações nos resultados dos métodos imunodiagnósticos disponíveis para detecção de anticorpos no líquido céfalorraqueano ou soro. Fator limitante das técnicas imunológicas para detecção de anticorpos é a presença, no soro, de componentes antigênicos comuns compartilhados por parasitas de diferentes espécies, induzindo reatividade cruzada das amostras de populações expostas a diferentes agentes infecciosos. A escassez de dados sobre prevalência da cisticercose no país se deve à não disponibilidade de ferramentas diagnósticas acessíveis. Desenvolveu-se este trabalho com o objetivo de contribuir para a aquisição destes instrumentos, visando ao estudo amplo de caráter epidemiológico sobre a ocorrência da cisticercose no estado de Santa Catarina, para orientação das medidas de controle e sua erradicação. Determinou-se a freqüência da reatividade de peptideos imunodominantes de Taenia solium e Taenia crassiceps, em Immunoblot, com amostras de soro do grupo controle positivo (CP) de cisticercose e grupo controle negativo (CN). Determinou-se a freqüência de positividade do Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) e Immunoblot (IB) para detecção de anticorpos anti-cisticercos de T. solium nas amostras de soro de diferentes grupos de população do estado de Santa Catarina: pacientes com crises epileptiformes (n=98), residentes de São José do Cerrito - SC (n=40) e da Costa da Lagoa (Ilha de Santa Catarina -SC) (n=27), doadores de banco de sangue do Hospital Universitário da Universidade Federal de Santa Catarina (n=33) e de pacientes atendidos em diferentes instituições, portadores de parasitoses (n=112), utilizando-se diferentes extratos antigênicos: total de cisticercos de T. solium (T-Tso ); líquido vesicular de cisticercos de T. crassiceps (VF-Tcra); extrato total de cisticercos de T. crassiceps purificado por cromatografia de afinidade em coluna Sepharose 4B-Concanavalina A (GP-Tcra); peptídeos de líquido vesicular de cisticercos de T. crassiceps, purificado por eletroforese preparativa (GP-(18-14)-Tcra]. Analisou-se a correlação entre os resultados dos testes sorológicos e as características das populações estudadas. Avaliou-se o desempenho do ELISA e IB para detecção de anticorpos anti-cisticercos de T. solium nas amostras de soro do grupo de pacientes com crises epileptiformes, empregando-se os antígenos mencionados. Analisou-se a concordância entre os resultados dos testes sorológicos e entre os resultados dos testes sorológicos e os de exames de tomografia computadorizada; analisou-se a correlação entre os resultados dos testes sorológicos e o tipo de lesão detectada nos exames de imagem. Avaliou-se a reatividade cruzada nas amostras de soro de pacientes com diferentes helmintíases e de animais experimentalmente imunizados, pelo ELISA e IB com os diferentes antígenos mencionados, além dos extratos antigênicos para diagnóstico da toxocaríase, esquistossomose e hidatidose cística, respectivamente: excreção e secreção de larvas de Toxocara canis (TES); total de vermes adultos de Schistosoma mansoni (T-Sma) e líquido hidático de Echinococcus granulosus (LH-Eg). Avaliou-se, com base nos parâmetros de sensibilidade e especificidade, o desempenho do ELISA e IB, para o seu potencial uso no sorodiagnóstico, utilizando antígenos homólogos e heterólogos com soros de pacientes com diferentes helmintíases. Adotou-se como critério de positividade no IB, para as amostras deste estudo, a reatividade com os peptídeos de 18-14 kDa e/ou 14-12 kDa tanto de antígeno total de cisticercos de T. solium (T-Tso) quanto de liquido vesicular de T. crassiceps (LV-Tcra) pois foram reagentes com 100% das amostras do grupo CP e com nenhuma do grupo CN. LV-Tcra, mais facilmente obtido em laboratório do que T-Tso, pode ser fonte alternativa de antígeno para o diagnóstico da cisticercose pois mostrou compartilhar epítopos antigênicos com T-Tso. Os resultados do ELISA e IB aplicados às amostras de diferentes procedências demonstraram elevados índices de positividade. A avaliação da associação entre resultados dos testes e a procedência dos indivíduos demonstrou, na sua maioria, não haver diferença significativa. Aparentemente, os padrões sócio-econômicos são similares, evidenciados pelo baixo grau de instrução destas populações. A concordância entre os testes ELISA e Immunobloting aplicados aos pacientes com crises epileptiformes, mostrou bons índices, na sua maioria (0,40,05). ELISA-LV-Tcra apresentou maior sensibilidade do que ELISA- T-Tso para detecção de anticorpos anti-cisticercos de T. solium tanto na fase ativa quanto calcificada da neurocisticercose. O IB-LV-Tcra demonstrou bom desempenho para diferenciar a fase da doença (ativa ou calcificada). ELISA-LV-Tcra pode ser empregado para triagem nos estudos soroepidemiológicos e deve ser complementado com o IB-LV-Tcra, teste mais específico, para confirmação dos resultados positivos no ELISA. Ocorreu reatividade cruzada no ELISA, principalmente entre infecções causadas por Taenia e Echinococcus e também nas amostras dos animais imunizados. Ocorreu, em menor grau, reatividade cruzada das amostras de soros humanos com cisticercose ou esquistosssomose, no ELISA com antígenos de Schistosoma e de Taenia, respectivamente, e das amostras de soros humanos com toxocaríase ou hidatidose, no ELISA com antígenos de Echinicoccus e Toxocara, respectivamente, que pode d ver-se a epítopos comuns compartilhados pelos parasitas. No IB, teste mais específico, ocorreu menor reatividade cruzada, especialmente com os peptídeos de cisticercos de T. crassiceps purificados por eletroforese preparativa [GP-(18-14)-Tcra]. Na análise da sensibilidade e especificidade dos testes com antígenos homólogos e heterólogos, o melhor resultado foi obtido com o IB-GP(18-14)-Tcra para o diagnóstico da cisticercose, sem diferença quanto ao desempenho obtido com IB-T-Tso (p=0,5). Entretanto, ELISA, com as glicoproteínas de T. crassiceps purificadas por cromatografia de afinidade em coluna (GP-Tcra) e IB, com os peptídeos obtidos por eletroforese preparativa [GP-(18-14)-Tcra], apresentaram baixa sensibilidade quando aplicados às amostras de pacientes com lesões ativas. Maiores estudos serão necessários para a identificação e purificação dos peptídeos imunodominantes no diagnóstico da cisticercose.
Título em inglês
Application of ELISA and Immunoblot in the diagnosis of cysticercosis on human serum samples from different population groups of Santa Catarina state and homologous and heterologous reactivity outline of Taenia sp antigens and other parasitic agents antigenicaly related
Palavras-chave em inglês
Antígenos
Cisticercose (Diagnóstico)
Testes imunológicos
Resumo em inglês
Neurocysticercosis (NC). infection caused by the larval stage of Taenia solium, is the commonest parasitic disease of the human nervous system and the main cause of epileptic seizures in developing countries, including Brazil. The diagnosis of NC is based on clinical, epidemiological and laboratorial data as imaging exams and immunological methods to detect antibodies or antigens in the cerebrospinal fluid or serum. The results of the immunodiagnostic methods available for detection of antibodies, depends on the humoral immune response of the host, which is variable according to the different phases of the disease. A drawback in the serological techniques is the cross-reactivity of the samples due to common antigenic components shared by different parasite species present in populations from precarious sanitary condition. The shortage of data about the prevalence of NC in Brazil is due to the lack of accessible diagnostic tools. This work was conducted with the objective of contributing to acquire these tools applicable in control epidemiological studies of NC in Santa Catarina state. The frequency of the reactivity of immunodominant peptides of Taenia solium and Taenia crassiceps, in Immunoblot, with serum samples of positive control group of cysticerocsis and negative control group was determined. The frequency of positivity of Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) and Immunoblot (IB) for detection of antibodies anti-cysticerci of T. solium in the serum samples from different population groups of Santa Catarina state: epileptic patients (n=98); residents of São José do Cerrito - SC (n=40) and Costa da Lagoa (Santa Catarina Island-SC) (n=27), blood donors of University Hospital of Federal University of Santa Catarina (n=33) and from patients attending on different institutions, harboring different parasites (n=112), using different antigenic extracts: Taenia solium cysticercus total saline (Tso-T); Taenia crassiceps cysticercus vesicular fluid (Tcra-VF); T. crassiceps cysticercus glycoproteins [Tcra-GP and Tcra-(18-14)-GP] were determined. The correlation between the results of the serological tests and the characteristics of the population studied was analysed. The performance of ELISA and IB for the detection of antibodies anti-cysticerci of T. solium in the serum samples of the epileptic patient group was evaluated using the antigens described above. The agreement between the results of the serological tests was analysed as well as between the results of the serological tests and the computed tomography (CT) exams; the correlation between the results of the serological tests and the type of lesion detected in the CT exams was analysed too. The cross-reactivity of the serum samples of patients presenting with different helminthiases and of immunized animals, by ELISA and m with the antigens described above, besides the antigens for the diagnosis of toxocariasis, schistosomiasis and hydatidosis, as follow, respectively: Toxocara canis larva excretory-secretory (TES), Schistosoma mansoni adult total saline (Sma-T) and Echinococcus granulosus hydatid fluid (HF-Eg) was evaluated. The ELISA and IB techniques using homologous and potentially useful heterologous antigens were evaluated as to their potential use for the serodiagnosis, based on parameters of sensitivity and specificity. The reactivity of the 18-14 kDa and/or 14-12 kDa peptides of both T. solium (T-Tso) and T. crassiceps (VF-Tcra) antigens was adopted as a positivity criterion for this study as these peptides reacted with 100% of the samples of tbe positive control group and none of the negative control group. VF-Tcra, easily obtained in laboratory, can be an alternative source of antigen for the diagnosis of cysticercosis, as it shares common antigenic components with T-Tso. The results of ELISA and IB when assayed with serum samples of different population groups demonstrated high positivity indices. The association between results of serological tests and the origin of the samples showed no significant difference, in the majority. It is supposed that the different groups of individuals have similar social economic status, as they have low education degree. The agreement between ELISA and 1B tests applied to epileptic patients showed a good indices, in the majority (0,40,05). ELISA with VF-Tcra showed greater sensitivity than with T-Tso to detect antibodies anti-cysticerci of T. solium, both in the calcified and in the active stage of the NC. m with VF-Tcra showed a good performance to distinguish between acticve and calcified stage of the NC. ELISA with VF-Tcra can be used for screening in epidemiological studies and must be supplemented with IB-VF-Tcra, more specific technique, to confirm the ELISA positive results. The ELISA cross-reactivity occurred mainly between Taenia and Echinococcus infections and also with the immunized animals samples. In the IB, a more specific technique than ELISA, there was lower cross-reactivity specially with the cysticerci of T. crassiceps peptides purified by preparative electrophoresis [GP-(18-14)-Tcra]. In the study of those techniques with homologous and heterologous sera from helminth infections, as to their potencial use for the serodiagnosis, the best result was obtained with IB-GP-(18-14)Tcra for the diagnosis of cysticercosis, with no statistical difference as to the performance of IB-T-Tso (p=0,5). However, ELISA with the glycoproteins of T. crassiceps purified by affinity chromatography (GP-Tcra) and IB with GP-(18-14)-Tcra showed low sensitivity to detect antibodies in the serum samples of patients presenting with active NC. Much knowledge concerning the identification and purification of the immunnodominant peptides are expected to improve the diagnosis of cysticercosis.
 
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Data de Publicação
2022-08-25
 
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