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Thèse de Doctorat
DOI
https://doi.org/10.11606/T.9.2020.tde-19022020-143436
Document
Auteur
Nom complet
Darlan Augusto da Costa Rocha
Adresse Mail
Unité de l'USP
Domain de Connaissance
Date de Soutenance
Editeur
São Paulo, 2019
Directeur
Jury
Sampaio, Jorge Luiz Mello (Président)
Lincopan, Nilton
Garcia, Doroti de Oliveira
Sandes, Alex Freire
Titre en portugais
Métodos rápidos para avaliação da susceptibilidade antimicrobiana em bacilos Gram-negativos
Mots-clés en portugais
Citometria de fluxo
Condutividade elétrica
Métodos rápidos
Resistência microbiana a drogas
Teste de sensibilidade microbiana
Resumé en portugais
Introdução. Bacilos Gram negativos são importantes agentes de infecções graves, particularmente no ambiente hospitalar. Nos últimos anos tem havido um número crescente de infecções por isolados produtores de carbapenemases, o que limita as opções de tratamento. Infecções por microrganismos multi-resistentes estão relacionados a taxas de mortalidade mais elevadas e a rapidez no diagnóstico e a terapia empírica combinada podem reduzir as taxas de mortalidade. A espectrometria de massas (MS) trouxe um grande ganho de tempo na identificação microbiana, mas os testes de sensibilidade a antibióticos (TSA), que fornecem resultados fidedignos e em uso na rotina clínica demandam 16 a 20 horas de incubação. O uso combinado da MS e métodos rápidos de TSA permitiria reduzir o tempo do ajuste terapêutico, potencialmente reduzindo a mortalidade. Há na literatura a descrição de novos métodos para TSA rápidos, mas a maioria não está comercialmente disponível. Dentre eles, a citometria de fluxo (CF) e métodos baseados em condutividade elétrica (CE) potencialmente atendem a demanda. Materiais e métodos. A determinação da concentração inibitória mínima (CIM) por microdiluição em caldo (MC) com leitura visual (18h) foi considerada o padrão ouro. A determinação das CIMs por CF foi realizada após 120 min de incubação a 37ºC, marcação com indicadores celulares, contagem celular padronizada com microesferas e algoritmo em linguagem R para análise de vários arquivos citométricos simultaneamente. A avaliação da sensibilidade foi realizada para polimixina B (PB), amicacina (AMI) e meropenem (MEM). Para padronização do método de CIM foram utilizadas as cepas Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, E. coli 3313 produtora de MCR-1, Klebsiella pneumoniae BAA-1705 produtora de KPC, K. pneumoniae J9243971 e Proteus mirabilis J9103900, além de 51 concentrados bacterianos provenientes de hemoculturas positivas para diferentes espécies. Além das concentrações convencionais, foram realizados testes com concentrações elevadas de PB e leitura após 15 min de incubação. As aquisições obtidas na presença de PB foram comparadas com aquelas obtidas sem exposição. O teste rápido por CE foi feito inicialmente padronizado com as cepas E. coli 3313 e P. mirabilis J9103900. Três tubos foram preparados: um com suspensão bacteriana, o segundo com suspensão submetida a sonicação e o terceiro com suspensão bacteriana exposta à PB. A seguir os três tubos foram analisados por CE. Resultados e discussão. Para a determinação da CIM por CF houve concordância essencial e categórica de 94,12% para AMI, concordância essencial de 94,12% e categórica de 98,04% para MEM e concordância essencial de 94,12% e categórica de 100% para PB quando comparadas com a CIM não automatizada, dessa forma houve apenas 5,88% de erros menores para AMI e 1,96% para MEM. A análise por CE permitiu diferenciar bactérias íntegras daquelas lisadas, entretanto, os ensaios contendo apenas solução de sulfato de polimixina B ou sulfato de sódio não foram reprodutíveis. Conclusões. Os resultados da determinação da CIM por CF indicam ótima correlação (>94%) com MC para PB, AMI e MEM. Os ensaios com CE permitiram diferenciar células íntegras de células lisadas, mas há necessidade de modificação do dispositivo de medição.
Titre en anglais
Fast methods for antimicrobial susceptibility assessment in Gram-negative bacilli
Mots-clés en anglais
Electric conductivity
Fast methods.
Flow cytometry
Microbial Sensitivity Test
Microbial drug resistance
Resumé en anglais
Introduction. Gram-negative bacilli are important agents of serious infections, particularly in the hospital setting. In recent years there have been a growing number of infections by carbapenemase-producing isolates, which limits treatment options. Multi-resistant microorganism infections are related to higher mortality rates and rapid diagnosis and combined empirical therapy may reduce mortality rates. Mass spectrometry (MS) has brought a great deal of time for microbial identification, but antibiotic susceptibility testing (AST), which provides reliable results and in routine clinical use, requires 16 to 20 hours of incubation. The combined use of MS and fast AST methods would reduce the time to therapeutic adjustment, potentially reducing mortality. New methods for fast AST are described in the literature, but most are not commercially available. Among them, flow cytometry (FC) and methods based on electrical conductivity (EC) potentially meet the demand. Materials and methods. The determination of the minimum inhibitory concentration (MIC) by broth dilution (BD) with visual reading (18h) was considered the gold standard. The determination of MICs by FC was performed after 120 min of incubation at 37ºC, marking with cellular indicators, standardized cellular counting with beads and R language algorithm for analysis of several cytometric files simultaneously. Sensitivity evaluation was performed for polymyxin B (PB), amikacin (AMI) and meropenem (MEM). For standardization of the MIC method, the strains Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, MCR-1 producer E. coli 3313, KPC producer Klebsiella pneumoniae BAA-1705, K. pneumoniae J9243971, Proteus mirabilis J9103900 and 51 bacterial concentrates from positive blood cultures for different species were used. In addition to conventional concentrations, tests with high concentrations of PB and reading after 15 min of incubation were performed. Acquisitions obtained in the presence of PB were compared with those obtained without exposure. The fast EC test was initially standardized with E. coli 3313 and P. mirabilis J9103900 strains. Three tubes were prepared: one with bacterial suspension, the second with sonication suspension and the third with bacterial suspension exposed to PB. Then the three tubes were analyzed by EC. Results and discussion. The determination of MIC by FC there was an essential agreement and categorical agreement of 94.12% for AMI, essential agreement of 94.12% and categorical agreement of 98.04% for MEM and essential agreement of 94.12% and categorical agreement of 100% for PB when compared to non-automated MIC, thus there were only 5.88% of minor errors for AMI and 1.96% for MEM. The analysis by EC allowed to differentiate intact bacteria from those lysed, however, the assays containing only polymyxin B sulfate solution or sodium sulfate were not reproducible. Conclusions. The results of the MIC determination by FC indicate an excellent correlation (> 94%) with BD for PB, AMI, and MEM. The EC assays allowed differentiating intact cells from lysed cells, but there is a need for modification of the measuring device.
 
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Date de Libération
2022-02-18
Date de Publication
2020-02-28
 
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