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Master's Dissertation
DOI
10.11606/D.9.2012.tde-11092012-134839
Document
Author
Full name
Raquel Brandão Haga
E-mail
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
São Paulo, 2012
Supervisor
Committee
Maria-Engler, Silvya Stuchi (President)
Lopes, Marilene Hohmuth
Shinjo, Sueli Mieko Oba
Title in Portuguese
Inibição da migração mediada pelo gene RECK em modelo de glioma humano através de alterações no citoesqueleto e adesão focal
Keywords in Portuguese
Adesão focal
Câncer
Citoesqueleto
Glioma
Migração
RECK
Abstract in Portuguese
Gliomas são tumores altamente invasivos, resistentes aos tratamentos disponíveis atualmente e com alta taxa de mortalidade. A superexpressão de RECK na linhagem de glioma humano T98G comprometeu a capacidade das células de migrar e invadir in vitro, com rearranjo do citoesqueleto e alteração na distribuição espacial de FAK fosforilado. Entretanto, o possível mecanismo envolvido na inibição da migração mediada por RECK não foi desvendado. Para estudarmos os mecanismos envolvidos nesta alteração da capacidade migratória, as células T98G foram transfectadas com o vetor plasmidial pCXN2-hRECK (RECK+). A via das integrinas, a atividade de alguns membros da família das RhoGTPases e elementos do citoesqueleto foram avaliados através de imunoblotting, imunomarcação e ensaios de pull-down para as células RECK+ em comparação com células T98G não-transfectadas (WT), células T98G transfectadas com vetor pCXN2 na ausência do gene RECK (vetor) e fibroblastos primários humanos (FF287). Nossos resultados mostram um aumento na expressão de integrina β1 e uma diminuição da fosforilação de FAK no sítio de auto-fosforilação Tyr397 que, juntamente com o aumento das fibras de estresse e a diminuição dos lamelipódios, sugerem um fenótipo menos migratório da célula. Porém, quando avaliada a atividade de Rac1, esta se mostrou aumentada, embora uma das vias de ativação de Rac1 seja através da fosforilação de FAK levando à formação dos lamelipódios. A hipótese é que RECK inibe a quebra das adesões focais que participam do processo de migração, dificultando a mobilidade celular. Como as células continuam recebendo o estímulo para migrar, estas ativam Rac1 através de uma via independente de FAK. Além disso, a imunomarcação de paxilina mostrou um aumento no tamanho das adesões focais nas células RECK+, indicando que RECK pode influenciar nas estruturas responsáveis pelo contato célula-matriz.
Title in English
RECK-mediated inhibition of glioma migration with changes in cytoskeleton and focal adhesion
Keywords in English
Cancer
Cytoskeleton
Focal adhesion
Glioma
Migration
RECK
Abstract in English
Gliomas are highly invasive, treatment-resistant and lethal tumors. Overexpression of RECK in human glioma cell line T98G decreased cell migration and invasion in vitro, lead to cytoskeleton rearrangement and caused changes in phospho-FAK distribution. However, the pathway involved in RECK-mediated inhibition of cell migration has not been elucidated yet. To study the mechanisms by which RECK affects cell motility, T98G cells were transfected with pCXN2-hRECK vector (RECK+). Some proteins involved in the integrin pathway, activity of some proteins of RhoGTPase family and cytoskeleton proteins were analyzed through immunoblotting, immunostaining and pull-down assay in RECK+ cells and compared with non-transfected T98G cells, T98G transfected with pCXN2 without RECK gene and human primary fibroblasts (FF287). Our results showed an increase in integrin β1 expression and a decrease in FAK phosphorylation in the Tyr397 site, which together with the increase of stress fibers and decrease of lamellipodia, suggest a less migratory phenotype. Despite this, Rac1 activity was increased even though one of Rac activation pathways is through phospho-FAK, leading to lamellipodium formation. Our hypotheses is that RECK affects focal adhesion turnover, diminishing cell motility. As cells are still receiving a positive signal to migrate, they activate Rac1 through a FAK-independent pathway. Besides that, paxillin immunostaining showed that focal adhesions are larger in RECK+ cells, indicating that RECK can influence structures related with cell-matrix contact.
 
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Publishing Date
2012-10-22
 
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