O perfil de antigenicidade das proteínas excretadas-secretadas pelas formas tripomastigotas (TESA) do T. cruzi apresenta, por immunoblotting (TESA-blot), duas moléculas imunodominantes que permitem o diagnóstico diferencial da doença de Chagas. TESA-blot mostra uma banda de 150-160 kDa amplamente reconhecida por soros de pacientes de fase crônica e uma outra, denominada SAPA (shed acute phase antigen), preferencialmente reativa com soros da fase aguda da doença de Chagas (Umezawa et al., 1996b). Além disso, moléculas de 160 kDa presentes somente na infecção ativa, consideradas potentes candidatas como marcadores de cura da doença de Chagas, foram descritas como alvo de anticorpos líticos (Krautz et al., 2000). A relevância destes antígenos orientou-nos na seleção de genes que codificam TESA das bibliotecas de DNA e de cDNA do T. cruzi, através de anticorpos anti-TESA ou sonda, para finalidades diagnósticas. Na primeira etapa, o clone recombinante TESA-1 foi selecionado de uma biblioteca genômica de T. cruzi, construída em λgt11 , com anticorpos anti-TESA purificados de um "pool" de soros chagásicos crônicos. O fragmento de 203 pbs do inserto de TESA-1 foi identificado com os genes CRP e FL-160 do Grupo III da Família Trans-sialidase que codificam proteínas de 160 kDa presentes na fração TESA do T. cruzi. TESA-1 expressou, em pGEX, um peptídeo solúvel de 10 kDa, especificamente reativo com soros de pacientes chagásicos. Soro hiperimune anti-TESA-1 demonstrou a presença do epítopo de TESA-1 nos antígenos tripomastigota e amastigota do T. cruzi, assim como reconheceu a banda de 150-160 kDa da fração TESA de 8 cepas do T. cruzi. Apesar de representar aproximadamente 8% dos genes CRP e FL-160 que codificam proteínas de 160 kDa, o epítopo de TESA-1 mostrou capacidade de reagir com 82,2% dos soros de pacientes chagásicos por Immunoblotting, com uma especificidade de 93,3%. Na segunda etapa, o próprio inserto do clone TESA-1 utilizado como sonda selecionou os clones 8a, 12a, 15b e 16a da biblioteca de cDNA do T. cruzi, construída em λZAP. A alta homologia destes clones com o gene Tc 13 do Grupo IV da Família Trans-sialidase do T. cruzi indica que a 103 sequência de TESA-1 poderá ser usada como alvo para a identificação deste grupo de moléculas ainda pouco estudadas. Na terceira etapa, anticorpos anti-TESA purificados de soros de pacientes das fases aguda e crônica da doença de Chagas selecionaram 26 clones da biblioteca de cDNA do T. cruzi, em λZAP. Desta seleção, 8 clones não mostraram identidade com qualquer sequência conhecida do T. cruzi e 15, foram identificados com genes da família Trans-sialidase (14 com os genes CEA, CRP e FL-160 de 160 kDa do Grupo III e 1 com o gene da TCNA/TCTS/SAPA do Grupo 1). Além disso, foram identificados outros clones não relacionados com a Família Trans-sialidase: 2 com a Família Hsp 70 e 1 com a desidrogenase do T. cruzi. As proteínas expressas pelos 31 clones recombinantes selecionados foram analisadas por Dot-blot com anticorpos anti-TESA purificados por afinidade de 8 soros de pacientes chagásicos (1 de fase aguda e 7 de fase crônica). Pelo Dot-blot, anticorpos anti-TESA purificados de soros chagásicos crônicos reconheceram somente proteínas expressas pelos clones recombinantes homólogos ao Grupo III. Somente o antígeno expresso pelo clone similar a TCNA/TCTS/SAPA reagiu com anticorpos anti-TESA purificados de soro chagásico agudo. Os clones recombinantes selecionados resultaram no fornecimento de uma importante fonte de proteínas excretadas e secretadas, especificamente reativas com anticorpos de pacientes chagásicos, que poderão ser úteis para o imunodiagnóstico da doença de Chagas. A grande quantidade de clones homólogos às proteínas de 160 kDa do T. cruzi possibilita o emprego, tanto individual como em mistura, dessas proteínas recombinantes para discriminar as fases da doença de Chagas ou monitorar a cura de pacientes submetidos ao tratamento específico para esta doença. Além disso, a mistura de antígenos recombinantes homólogos às proteínas de 160 kDa do T. cruzi com aqueles homólogos à TCNA/TCTS/SAPA poderá fornecer um teste altamente sensível e eficaz para o sorodiagnóstico da doença de Chagas.

Antigenicity profile of trypomastigote excreted-secreted antigens (TESA) of T. cruzi presents by immunoblotting (TESA-blot) two immunodominant molecules that permit the differential diagnostic of Chagas' disease. TESA-blot shows one 150-160 kDa band widely recognized by sera from chronic phase patients and another, called SAPA (shed acute phase antigen), preferentially reactive with sera from acute phase patients of Chagas' disease (Umezawa et al., 1996b). Furthermore, 160 kDa molecules only present in the active infection, considered potential candidate as cure markers of the Chagas'disease, were described as target of the lytic antibodies (Krautz et al., 2000). The relevance of these antigens orientated us to isolate genes that codify TESA by screening DNA and cDNA expression library of T. cruzi with anti-TESA antibodies and probe, for diagnostic purposes. In the first step, the recombinant clone TESA-1 was isolated by screening a T. cruzi genomic library, constructed in λgt11, with anti-TESA antibodies purified from a pool of chronic chagasic sera. The 203 bp fragment of TESA-1 insert was identified with CRP and FL-160 genes of Group III from the Trans-sialidase Family that codify 160 kDa proteins present in the T. cruzi TESA fraction. TESA-1 expressed in pGEX a 10 kDa soluble peptide, specifically reactive with sera from chagasic patients. Anti-TESA-1 hyperimmune serum demonstrated the presence of the TESA-1 epitope in the trypomastigote and amastigote antigens of T. cruzi, as well as recognized the 150-160 kDa band from the TESA fraction of eight T. cruzi strains. In spite of the TESA-1 epitope representing approximately 8% of CRP and FL-160 genes that codify 160 kDa proteins, it showed ability to react with 82,2% of the sera from chagasic patients by Immunoblotting, with a specificity of 93,3%. ln the second step, the insert of TESA-1 clone itself used as probe selected the clones 8a, 12a, 15b e 16a from the cDNA of T. cruzi library, constructed in λZAP. The high homology of these antigens with the Tc 13 gene of Group IV from the Trans-sialidase Family of T. cruzi indicates that TESA-1 sequence can be used as target for identification of these molecules group, still little studied. In the third step, anti-TESA antibodies purified from sera of acute and chronic patients with Chagas'disease selected 26 clones of the T. cruzi cDNA library, constructed in λZAP. From this selection, 8 clones did not demonstrate identity with any known sequence of T. cruzi and 15 were identified with genes of the Trans-sialidase Family (14 with CEA, CRP and FL-160 genes of the Group III and 1 with TCNA/TCTS/SAPA gene of the Group I). Furthermore, other clones not related to Trans-sialidase Family were identified: 2 with the Hsp 70 Family and 1 with the T. cruzi dehydrogenase. Proteins expressed by 31 selected recombinant clones were analysed by Dot-blot with affinity purified anti-TESA antibodies from eight chagasic patient sera (1 from acute phase and 7 from chronic phase). By Dot-blot, anti-TESA antibodies purified from chronic chagasic sera recognized only proteins expressed by recombinant clones homologous to Group III. Only the antigen expressed by clone similar to TCNA/TCTS/SAPA reacted with anti-TESA antibodies purified from acute chagasic sera. The selected recombinant clones resulted in the supply of an important source of specific excreted-secreted proteins, specifically reactive with antibodies from chagasic patients that can be useful for the immunodiagnostic of Chagas' disease. The enormous quantity of clones homologous to 160 kDa proteins of T. cruzi make it possible the use of these recombinant proteins, individually as much as in mixture, to discriminate the phases of Chagas' disease or to monitor the cure of patients submitted to specific treatment for the disease. Furthermore, the mixture of recombinant antigens homologous to 160 kDa proteins of T. cruzi with those homologous to TCNA/TCTS/SAPA can provide a highly sensible and efficient test for the serodiagnosis of Chagas' disease.