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Master's Dissertation
DOI
10.11606/D.9.2003.tde-01102004-164856
Document
Author
Full name
Abdiel Aparecido Moreira
E-mail
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
São Paulo, 2003
Supervisor
Committee
Araujo, Adele Caterino de (President)
Segurado, Aluisio Augusto Cotrim
Ueda, Mirthes
Title in Portuguese
"Pesquisa de sítios de restrição enzimática em segmento da ORF K1 do genoma de herpesvírus humano tipo 8 (HHV-8) em isolados clínicos de São Paulo: relação com subtipos virais e implantação da técnica de RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism Analyses) para determinar subtipos virais"
Keywords in Portuguese
HHV-8
PCR-RFLP
sarkoma kaposi
sitios de Restrição
subtipos virais
Abstract in Portuguese
A epidemia da Síndrome de Imunodeficiência Adquirida (AIDS) fez aumentar a incidência de sarcoma de Kaposi (SK) em todos os países e o SK passou a ser considerado doença definidora de AIDS. Desde a descoberta de seu agente etiológico, o herpesvírus humano tipo 8 (HHV-8), vários estudos vêm sendo realizados com o objetivo de caracterizar subtipos virais presentes em todas as formas de SK: clássica, endêmica, iatrogênica e epidêmica. Os sistemas rotineiramente usados na subtipagem do HHV-8 têm usado o seqüenciamento de um gene que contém regiões hipervariáveis e que codifica uma glicoproteína de membrana viral (ORF K1). O presente trabalho apresenta um sistema de subtipagem alternativo que se baseia na presença de sítios de restrição enzimática em um pequeno segmento do gene ORF K1, região hipervariável 1 (VR1) e que permite discriminar subtipos virais. A análise de 68 seqüências; 50 que pertenciam a 36 pacientes com sarcoma de Kaposi infectados e não infectados pelo HIV-1 de São Paulo e 18 a protótipos dos subtipos A a E, mostraram mapas de restrição enzimática característicos dos principais subtipos virais descritos até o momento. Tomando como base apenas as enzimas disponíveis comercialmente, foram selecionadas cinco que se mostraram úteis para a subtipagem de HHV-8: Taq I, Nsi I, Hinf I, Hae III e Mse I. Os resultados obtidos com a técnica de PCR-RFLP (reação em cadeia de polimerase associada à análise do polimorfismo de fragmentos de restrição enzimática) mostraram que de 48 espécimes brasileiros previamente classificados como sendo dos subtipos A, B e C por seqüenciamento gênico, todos foram corretamente subtipados pela técnica de PCR-RFLP. Três amostras (duas do subtipo A e uma do B) apresentaram mais um sítio de restrição enzimática além dos descritos como sendo os predominantes. Mais recentemente, outras 27 amostras de 18 casos de infecção por HHV-8 foram subtipadas pela PCR-RFLP. Houve detecção de oito isolados do subtipo A, sendo seis de variante predominante, um de variante minoritária conhecida e um de nova variante viral. Dois casos de infecção por HHV-8 do subtipo B e sete do subtipo C também foram identificados. Finalmente, um provável caso de infecção pelo subtipo E foi encontrado em paciente com SK-AIDS disseminado, resistente à quimioterapia. Na avaliação global, houve maior número de casos de infecção por HHV-8 dos subtipos A e C. Concluindo, devido à alta sensibilidade e especificidade, baixo custo, rapidez e facilidade de execução, a técnica de PCR-RFLP pode ser usada em larga escala para estudos de epidemiologia molecular, principalmente em países em desenvolvimento.
Title in English
"Research of the restriction enzymatic sites in segment from ORF K1 genome HHV-8, isolates from KS-AIDS patients of São Paulo. Standardized a PCR-RFLP (restriction fragment length polymorphism analysis for HHV-8 subtyping"
Keywords in English
HHV-8
HHV-8 subtyping
PCR-RFLP
Sarcoma kaposi
Abstract in English
AIDS epidemic has increased the incidence rates of Kaposi’ s sarcoma (KS) in all countries, and KS has been considered an AIDS-defining illness. Since the discovery of the human herpesvirus 8 (HHV-8), the etiological agent of KS, several studies have been conducted in order to characterize HHV-8 in all forms of KS: classic, endemic, iatrogenic, and epidemic. The HHV-8 genome presents a hypervariable region termed ORF K1 useful for virus subtyping. The objectives of the present study were to describe an alternative method for subtyping HHV-8, to compare this new method with DNA sequencing, and to use this method for HHV-8 subtyping. After cloning and sequencing a segment of the ORF K1 (VR1) in 50 HHV-8/DNA isolates from 36 Brazilian KS-AIDS patients, we searched for restriction enzymatic sites in this segment of DNA, and compared them with 18 sequences reported in the literature. Then we constructed the enzymatic restriction maps useful for discriminating all HHV-8 subtypes described up to now, and standardized a PCR-RFLP (restriction fragment length polymorphism analysis) using five commercial enzymes: Taq I, Nsi I, Hinf I, Hae III e Mse I. After comparing the results obtained by the two methods, we used PCR-RFLP for HHV-8 subtyping in 27 new HHV-8/DNA isolates. The results obtained by DNA sequencing and PCR-RFLP showed 100% of concordance, and allowed the use of PCR-RFLP for HHV-8 subtyping. Indeed, we disclosed that among KS-AIDS patients from São Paulo, subtypes A and C are more prevalent than subtype B. Although additional restriction sites were detected in some Brazilian HHV-8 isolates, the majority of them belonged to the predominant strains described in the literature. Interestingly, one probable case of HHV-8 subtype E was detected in a patient who presented disseminated KS and resistance to chemotherapy. Because of its high sensitivity, specificity, low cost, and rapid execution, PCR-RFLP could be used on a large scale, mostly in countries with poor resources and where KS is endemic.
 
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Publishing Date
2004-11-12
 
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