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Tese de Doutorado
DOI
10.11606/T.9.2011.tde-21032013-125043
Documento
Autor
Nome completo
Laura de Oliveira Nascimento
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Paulo, 2011
Orientador
Banca examinadora
Stephano, Marco Antonio (Presidente)
Borges, Monamaris Marques
Farsky, Sandra Helena Poliselli
Gallina, Neuza Maria Frazatti
Santos, Carolina Alves dos
Título em português
Porinas e suas ações imunomoduladoras dependentes de TLR2
Palavras-chave em português
Adjuvante
IL-8
Porina
TLR2
Vacinação intranasal
Vírus da raiva
Resumo em português
Os micro-organismos podem infectar seu hospedeiro por diferentes vias, sendo a principal o trato respiratório. O reconhecimento pela mucosa dessas vias pode desencadear inibição da proliferação e bloqueio da entrada microbiana, assim como estimular resposta direcionada a memória imunológica para prevenir posteriores infecções. Alguns micro-organismo, como as bactérias Neisseria meningitidis e Neisseria lactamica, são capazes de modular a resposta imune de mucosa diretamente, ou por meio das células epiteliais respiratórias. Este trabalho propôs, então, a avaliação das porinas B provenientes destas bactérias como moduladoras da produção de IL-8 nas linhagens BEAS-2B e Detroit 562. Também foi avaliada a dependência deste estímulo ao receptor TLR2. Ambas as porinas se ligaram a TLR2 e por este receptor estimularam a produção de IL-8. O perfil de produção foi dependente da expressão de TLR2 pelas células. A porina lactâmica induziu menos IL-8 por regular negativamente a expressão de TLR2, mas sua afinidade pelo receptor se mostrou maior que a da porina meningocócica. As porinas são então moduladoras das células de mucosa, fato que somado a atividade adjuvante destas proteínas por via parenteral estimulou a avaliação destas como adjuvantes de mucosa. O modelo escolhido para a avaliação foi o de inoculação intranasal de camundongos, utilizando como antígeno o lipopolissacarídio pouco imunogênico de Franciscella tularensis atenuada (Ft-LPS). A análise foi baseada no título de anticorpos IgG e IgM séricos. A porina meningocócica se mostrou a mais imunogênica, mas por ser originária de patógeno acarreta maior risco biológico em sua produção. Para viabilizar a porina meningocócica como adjuvante, a mesma foi substituída por porina homóloga produzida de modo recombinante em Escherichia coli não patogênica. A porina recombinante foi avaliada pelo mesmo sistema in vivo e comparada a adjuvantes experimentais de ação conhecida (rCTB, QS-21 e ODN 1826). A porina apresentou o melhor desempenho entre todos os adjuvantes, principalmente dois meses após o fim do esquema vacinal. O mesmo adjuvante foi adicionado ao vírus da raiva para caracterizar a amplitude de antígenos para sua aplicação e o efeito biológico dos anticorpos induzidos. Os resultados obtidos por via intranasal com antígeno da raiva confirmaram a propriedade de adjuvante de mucosa da porina recombinante, aumentando os títulos de IgG séricos. O ensaio biológico dos anticorpos por RFFIT comprovaram a funcionalidade dos anticorpos gerados, neutralizando a infectividade viral em células BHK-21. O uso da porina por via subcutânea não aumentou o nível de anticorpos neutralizantes, mas aumentou o de IgG. Não foi detectada imunidade celular específica de linfócitos do baço ao vírus da raiva nos parâmetros avaliados, independente da adição de adjuvantes. Em resumo, as porinas foram caracterizadas como relevantes na imunomodulação de células da mucosa respiratória por infecção meningocócica. A modulação também foi relevante para o aumento de resposta humoral frente a diferentes antígenos, por diferentes vias de administração, o que demonstra a eficiência e versatilidade da porina recombinante como adjuvante imunológico.
Título em inglês
Porins and their immunomodulatory effects triggered by TLR2
Palavras-chave em inglês
Adjuvant
IL-8
Intranasal vaccination
Porin
Rabies virus
TLR2
Resumo em inglês
Microorganisms can invade the host through many routes, specially the respiratory tract. The respiratory mucosa is responsible for recognition, inhibition, proliferation and entry blockade of microorganisms, besides incitation of immunological memory to prevent further infections. Some microorganisms, such as Neisseria meningitidis and Neisseria lactamica, can modulate the mucosa immune response directly or through stimulation of respiratory epithelial cells. The present work proposed the evaluation of porin B proteins, derived from these microorganisms, as modulators of IL-8 production on respiratory epithelial cell strains BEAS-2B and Detroit 562. TLR2 receptor dependency for the modulation was also evaluated. Both porins bounded to TLR2 and through this receptor were able to stimulate IL-8 production, whereas this profile was correlated with TLR2 expression. Lactamica porin (Nlac PorB) induced less IL-8 and TLR2 expression, also for a shorter period of time. The effect caused by Nlac PorB was attributed to TLR2 down regulated expression, since its binding affinity to the receptor is greater than meningococcal porin (Nmen PorB). Porins were therefore able to immune modulate mucosal cells, fact that allied with their parenteral adjuvant activity incited evaluation of porins as potential mucosal adjuvants. The model chosen for the evaluation was intranasal immunization of mice, using as the antigen a low immunogenic lipopolysaccharide extracted from attenuated Franciscella tularensis (Ft-LPS). The evaluation was based on IgG and IgM serum titers. After the immunization scheme, Nmen PorB induced higher IgG and IgM titers than Nlac PorB. Although Nmen PorB was more efficient, it comes from a pathogen. To overcome the risk of its production, it was replaced by recombinant porin (rPorB) produced by Escherichia coli. rPorB was evaluated by the same model and compared with well known experimental adjuvants (rCTB, QS-21 e ODN 1826). rPoB had the highest IgM and IgG titers among all adjuvants tested, specially two months after vaccination. The same adjuvant was also combined with a viral antigen to characterize its application wideness and biological function of incited antibodies. Results obtained with rabies antigen by intranasal route confirmed the mucosal adjuvant properties of rPorB, increasing IgG titers induced by the antigen. These antibodies were also capable of virus neutralization, as demonstrated in RFFIT assays. rPoB didn´t raise neutralizing antibody titers by subcutaneous route, but increased IgG titers. Cellular immunity was undetectable in spleen lymphocytes with the screening method used, regardless of adjuvant addition. In conclusion, porins were characterized as revelant for immunomodulation of the respiratory mucosal cells, caused by infection with meningococcus. The immunomodulation was also revelant for increase of humoral reponse to different antigens and by different routes, pointing out recombinant porin B as an efficient and versatile immunological adjuvant.
 
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Data de Publicação
2013-04-02
 
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