L-asparaginase é um importante biofármaco utilizado no tratamento da leucemia linfoblástica aguda (LLA). Porém, o tratamento com esta enzima produz efeitos colaterais imunogênicos e neurológicos. Neste contexto, a procura de novas fontes, assim como diversas técnicas de engenharia de proteínas são aplicadas para o melhoramento da enzima com o objetivo de mitigar os efeitos colaterais, aumentar sua atividade antitumoral e evitar falhas na quimioterapia. Neste estudo, é relatado a construção de uma proteína de fusão composta pela L-asparaginase quimérica (especificamente o clone 63_N-h_C constituída pelas sequencias das L-asparaginases gpASNase1 de guinea pig e da hASNase1 humana) e a enzima Arginase I humana (ARG1). A L-asparaginase 63_N-h_C foi fundida ao N-terminal da ARG1 por meio de um peptídeo ligante ou linker rígido. O vetor recombinante 63_N-h_C -linker-ARG1/pET-22b(+) foi construído para expressar a proteína de fusão em linhagens de Escherichia coli. Inicialmente, foram feitos diferentes testes de expressão da proteína de fusão, nas quais foram testadas linhagens de E. coli e diferentes condições de indução, entre as quais estavam temperatura e tempo de pósindução e concentração do indutor IPTG (Isopropil-β-D-1-tiogalactopiranosídio). A expressão da proteína foi obtida com sucesso em cultivos com as linhagens de E. coli ArcticExpress (DE3), BL21 (DE3) e AD494, as três linhagens com temperatura de pósindução de 20°C e concentração de 0,01 mM IPTG. Embora as diferentes condições de indução tenham sido testadas, o acúmulo do produto expresso na forma de corpos de inclusão ocorreu independentemente das variáveis modificadas. Foi empregada uma metodologia clássica de extração de proteína a partir de corpos de inclusão, que consiste em isolamento dos agregados proteicos utilizando um método combinado de sonicação e lise enzimática, seguido de etapa de solubilização, com agentes caotrópicos e detergentes, e redobramento da proteína, mediante o uso de tampões com aditivos promotores de redobramento e desagregação proteica. Os melhores resultados quanto a quantidade de corpos de inclusão extraídos se obteve com a linhagem ArcticExpress (DE3) registrando uma concentração de proteínas totais de 52 ± 4,0 mg/mL. Além disto, determinou-se que a proteína de fusão, mesmo em estado de agregação, apresentou atividade enzimática L-asparaginase e arginase. Mas, uma vez redobrada nas condições até agora testadas, a proteína de fusão não conseguiu recuperar sua atividade enzimática indicando possíveis alterações pela fusão das enzimas. Os resultados aqui apresentados mostram a definição da linhagem e as condições de expressão da enzima L-asparaginase fusionada a outra enzima, no caso a Arginase I, apresentando a viabilidade e funcionalidade da dita construção.

L-asparaginase is an important biopharmaceutical used in the treatment of acute lymphoblastic leukemia (ALL). However, treatment with this enzyme produces immunogenic and neurological side effects. In this context, the search for new sources, as well as several protein engineering techniques are applied for the improvement of the enzyme in order to mitigate the side effects, increase its antitumor activity and avoid chemotherapy failures. In this study, the construction of a fusion protein composed of the chimeric L-asparaginase (specifically the 63_N-h_C clone constituted by the sequences of the L-asparaginases gpASNase1 from guinea pig and the human hASNase1) and the enzyme human Arginase I (ARG1) is reported. . L-asparaginase 63_N-h_C was fused to the N-terminus of ARG1 by means of a peptide linker or rigid linker. The recombinant vector 63_N-h_C-linker-ARG1/pET-22b(+) was constructed to express the fusion protein in Escherichia coli strains. Initially, different fusion protein expression tests were performed, in which E. coli strains and different induction conditions were tested, among which were post-induction temperature and time and IPTG inducer concentration (Isopropyl--D -1- thiogalactopyranoside). Protein expression was successfully obtained in cultures with the strains of E. coli ArcticExpress (DE3), BL21 (DE3) and AD494, the three strains with a post-induction temperature of 20°C and a concentration of 0.01 mM IPTG . Although the different induction conditions were tested, the accumulation of the product expressed in the form of inclusion bodies occurred independently of the modified variables. A classic methodology of protein extraction from inclusion bodies was used, which consists of isolating the protein aggregates using a combined method of sonication and enzymatic lysis, followed by a solubilization step, with chaotropic agents and detergents, and protein refolding, through the use of buffers with additives that promote protein refolding and breakdown. The best results regarding the amount of inclusion bodies extracted were obtained with the ArcticExpress (DE3) strain, recording a total protein concentration of 52 ± 4.0 mg/mL. Furthermore, it was determined that the fusion protein, even in the aggregation state, showed L-asparaginase and arginase enzymatic activity. But, once redoubled under the conditions tested so far, the fusion protein was not able to recover its enzymatic activity, indicating possible alterations by the fusion of the enzymes. The results presented here show the definition of the lineage and the expression conditions of the enzyme L-asparaginase fused to another enzyme, in this case Arginase I, showing the feasibility and functionality of said construction.