A leucemia linfoblástica aguda (LLA) é a neoplasia mais frequente em crianças e adolescentes. Esse tumor tem como característica a auxotrofia para o aminoácido Lasparagina, o que permite que o tratamento da doença seja feito com a L-asparaginase (ASNase), enzima obtida a partir das bactérias Escherichia coli e Dickeya chrysanthemi (também denominada Erwinia chrysanthemi). A ASNase hidrolisa a L-asparagina, e Lglutamina em menor quantidade, impedindo que as células tumorais obtenham L-asparagina da circulação sanguínea para síntese de proteínas, levando a morte celular por apoptose. No entanto, as formulações disponíveis para terapêutica estão associadas a um alto índice de efeitos adversos, como toxicidade e a resistência ao medicamento causada pela produção de anticorpos e pela ação de proteases. Desta maneira, o desenvolvimento de proteoformas mutantes a partir das enzimas já comercializadas e o estudo da ação de proteases durante o tratamento podem contribuir para o desenvolvimento de uma enzima com menos efeitos adversos. Por isso, o nosso grupo de pesquisa criou uma biblioteca de mutantes utilizando a ASNase de D. chrysanthemi, por PCR propenso a erro, e de dez clones mutantes estudados uma proteoforma dupla mutante (DM) apresentou melhores parâmetros cinéticos do que a enzima selvagem (WT), sendo altamente ativa em condições fisiológicas testadas in vitro. Além disso, a enzima DM apresentou um menor reconhecimento por anticorpos antiasparaginase e o mesmo potencial citotóxico do que a enzima WT, podendo ocasionar menos efeitos adversos. Além disso, criamos as células de LLA REH knockout para protease catepsina B (CTSB) por CRISPR/cas9, e avaliamos a viabilidade celular após o tratamento com as ASNases WT de E. coli e D. chrysanthemi, e com a enzima DM. Os nossos resultados sugerem que a expressão de CTSB pelas células REH é muito baixa e não alteram a resposta ao tratamento com ASNases quando avaliadas in vitro.