O fator de crescimento de fibroblastos 2 (FGF2) apesar de induzir proliferação celular em diversos contextos, inibe irreversivelmente a proliferação de células tumorais com o oncogene k-ras superexpresso, como nas células Y1, na transição G2/M do ciclo celular. Para entender melhor o mecanismo molecular induzido por este fator, objetivamos entender como o proteoma da célula está respondendo a esse estímulo. Propusemos analisar por proteômica quantitativa as alterações induzidas por FGF2, no extrato total, na cromatina, nucléolo e nos loci de rDNA. No proteoma total, mais de 2900 proteínas foram quantificadas, indicando que os termos associados ao metabolismo, processamento de RNA, replicação e transcrição estão enriquecidos entre as proteínas diferencialmente expressas no estímulo com FGF2. A análise da rede reguladora de transcrição indica os membros de AP-1 (principalmente FosB), como reguladores principais da sinalização de FGF2. A expressão de JunB começa após 1 h do estímulo com FGF2 e atinge o pico após 5 h, a expressão de FosB após 3 h a 24 h, com pico de 3 h a 8 h. Ambos os níveis de abundância dessas proteínas dependem do receptor do fator de crescimento de fibroblastos (FGFR) e da sinalização src. O knockdown de JUNB e FOSB não resgata as células da parada de crescimento induzida por FGF2; no entanto, o knockdown do FOSB resgata as células do atraso na replicação do DNA, indicando que a abundância do FOSB está subjacente ao atraso na progressão da fase S. No proteoma da cromatina, mais de 5000 proteínas foram identificadas, sendo mais de 300 proteínas down reguladas após o estímulo com FGF2 por 24 h, incluindo diversas proteínas associadas a RNA polimerase II. Foi demonstrado uma modulação da transcrição global pelo estímulo com FGF2, através de ensaio de run-on, apresentando efeitos opostos em tempos curtos e longo de estímulo. No proteoma nucleolar, mais de 1200 proteínas foram identificadas, indicando que termos associados a transcrição, processamento de rRNA e biogênese de ribossomos estão enriquecidos entre as proteínas diferencialmente expressas por FGF2. Diversas proteínas pertencentes a complexos remodeladores da cromatina estão diferencialmente expressas no nucléolo após o estímulo com FGF2, sugerindo uma modulação do estado transcricional do rDNA. Foi identificado aumento nos transcritos de rRNA imaturo após o estímulo com FGF2 por 24 h, podendo ser um indício de aumento da transcrição ou da atividade da RNA Polimerase I. No entanto, os ribossomos maduros parecem não estar sendo afetados e há uma desorganização nucleolar, observada através da dispersão da marcação da fibrilarina, após o estímulo com FGF2. No proteoma dos loci de rDNA, 556 proteínas foram identificadas, sendo 27 diferencialmente expressas após o estímulo com FGF2. Dentre essas proteínas destacamos as proteínas Nolc1 e Tcof1, que dentre outras funções, participam do processamento do rRNA, principalmente no que concerne a modificações pós-transcricionais de rRNA, e modulação dos ribossomos. Em conjunto, esses resultados demostram que o estímulo antiproliferativo de FGF2 dispara alterações transcricionais importantes, desde a superativação de genes de reposta imediata, até a modulação do principal sítio de transcrição celular, o nucléolo, modulando diretamente o rDNA.

Fibroblast growth factor 2 (FGF2), despite inducing cell proliferation in several contexts, irreversibly inhibits the proliferation of tumor cells with the k-ras oncogene overexpressed, as in Y1 cells, in the G2/M transition of the cell cycle. To better understand the molecular mechanism induced by this factor, we aim to understand how the cell's proteome is responding to this stimulus. We proposed to analyze by quantitative proteomics the alterations induced by FGF2, in the total extract, in the chromatin, nucleolus and in the rDNA loci. In the total proteome, more than 2900 proteins were quantified, indicating that the terms associated with metabolism, RNA processing, replication and transcription are enriched among the differentially expressed proteins in the FGF2 stimulus. Analysis of the transcriptional regulatory network indicates members of AP-1 (mainly FosB) as major regulators of FGF2 signaling. JunB expression starts after 1 h of FGF2 stimulation and peaks after 5 h, FosB expression after 3 h to 24 h, peaking at 3 h to 8 h. Both levels of expression of these proteins depend on fibroblast growth factor receptor (FGFR) and src signaling. JUNB and FOSB knockdown does not rescue cells from FGF2-induced growth arrest; however, FOSB knockdown rescues cells from delayed DNA replication, indicating that FOSB expression underlies the delay in S-phase progression. In the chromatin proteome, more than 5000 proteins have been identified, with more than 300 proteins downregulated after stimulation with FGF2 for 24 h, including several proteins associated with RNA polymerase II. A modulation of global transcription was demonstrated by stimulation with FGF2, through a run-on assay, showing opposite effects in short and long stimulation times. In the nucleolar proteome, more than 1200 proteins were identified, indicating that terms associated with transcription, rRNA processing and ribosome biogenesis are enriched among the proteins differentially expressed by FGF2. Several proteins belonging to chromatin remodeling complexes are differentially expressed in the nucleolus after stimulation with FGF2, suggesting a modulation of the transcriptional state of rDNA. An increase in immature rRNA transcripts was identified after stimulation with FGF2 for 24 h, which may be an indication of increased transcription or RNA Polymerase I activity. However, mature ribosomes seem not to be affected and there is nucleolar disorganization, observed through the dispersion of the fibrillarin label, after stimulation with FGF2. In the rDNA loci proteome, 556 proteins were identified, 27 of which were differentially expressed after stimulation with FGF2. Among these proteins, we highlight the Nolc1 and Tcof1 proteins, which, among other functions, participate in the processing of rRNA, mainly regarding post-transcriptional modifications of rRNA, and modulation of ribosomes. Taken together, these results demonstrate that the antiproliferative stimulus of FGF2 triggers important transcriptional changes, from the overactivation of immediate response genes, to the modulation of the main cell transcription site, the nucleolus, directly modulating rDNA.