As peptidases desempenham um papel importante para o bom funcionamento fisiológico dos mais diversos organismos. Quando desreguladas, estão associadas a patologias, por exemplo, a atividade exacerbada da elastase-1 está relacionada à pancreatite, e, da catepsina L, está envolvida na metástase de tumores. Portanto estas peptidases se tornaram potenciais alvos terapêuticos, no que se refere à procura por inibidores. O veneno de serpentes é composto por misturas complexas de moléculas que podem apresentar as mais derivadas funções, inclusive a inibição de enzimas. Tendo isto em vista, este trabalho teve como objetivo, purificar, caracterizar e estudar in vitro e in silico novos inibidores presentes nas porções de baixa massa molecular dos venenos de três gêneros de serpentes africanas, Naja, Dendroaspis e Bitis. Para isso, as porções de baixa massa molecular (<10 kDa) de cada veneno foram submetidas a uma cromatografia por RP-HPLC usando uma coluna C18. As frações foram coletadas e um screening, utilizando substratos FRET, foi feito para verificação da inibição sobre as peptidases estudadas neste trabalho. A identificação das frações de interesse foi realizada por espectrometria de massas, dentre as sequências obtidas, moléculas da classe das three-finger-toxins foram identificadas, e, pela primeira vez descritas como inibidores de peptidases. Outras moléculas, da classe dos Kunitz, que foram anteriormente descritas como bloqueadores de canais de Na⁺ e K⁺, também foram identificadas. O peptídeo DPSA8 (do veneno de Dendroaspis polylepis) se destacou por apresentar inibição semelhante da catepsina L e da elastase-1 no teste de screening. Este peptídeo, classificado como Kunitz, foi caracterizado como um inibidor acompetitivo para a elastase-1, com um K_i de 8 µM. A análise por ancoramento (ZDOCK) indicou modelos de interação deste peptídeo com a elastase-1, dentre estes modelos foram mostradas interações no sítio catalítico e em outras regiões da enzima. Utilizando estes modelos de interação, dois peptídeos foram desenhados para serem estudados quanto à possível inibição da elastase-1 e da catepsina L. O primeiro não apresentou atividade inibitória, entretanto, o segundo, um peptídeo cíclico nomeado PEP2 (contendo 30 resíduos de aminoácido), mostrou ser um inibidor competitivo, com K_i de 1,96 µM sobre a catepsina L. Além disso, foi realizada a análise de ancoramento dos BPPs, do veneno de Bitis spp, usando a ECA (enzima conversora de angiotensina I) como receptor. Estes resultados mostraram uma alta relação dos scores obtidos nos estudos in silico com os Kis obtidos e já publicados. Este trabalho descreve algumas toxinas de baixa massa molecular com a função inibitória de peptidases, isso pode contribuir para um entendimento maior do processo de envenenamento. Em adição, foi empregado o método de ancoramento molecular para o desenho de novas moléculas inibidoras, resultando no PEP2, um peptídeo capaz de inibir a atividade da catepsina L com uma baixa constante de inibição. Mostrando mais uma vez que esta metodologia pode contribuir para a procura de novas entidades biotecnológicas.

Peptidases play an important role for the proper physiological functions of the most diverse organisms. When unregulated, they are associated to pathologies, for example, the exacerbated activity of elastase-1 is related to pancreatitis, and, for the cathepsin L, it is involved in the tumors metastasis. Therefore these peptidases have become potential therapeutic targets regarding the search for inhibitors. The venoms of snakes are composed by complex mixtures of molecules that can feature diverse functions, including the inhibition of enzymes. Considering this, the present works objective was to purify, characterize and to study in vitro and in silico new inhibitors that are present in the low molecular weight fraction of the venoms from three African snakes genera, Naja, Dendroaspis and Bitis. For that, the low molecular weight fraction from each venom (<10 kDa) were submitted to RP-HPLC chromatographic fractioning, using a C-18 column. The fractions were them collected, and utilizing fluorescent substrates, the screening test was performed to verify the inhibition by the fractions over the peptidases studied in this work. The identification of the fractions of interest was carried out by mass spectrometry, among them, molecules from the three-finger-toxins class was identified, and, for the first time, described as peptidase inhibitors. Other molecules from Kunitz class, that were previously described as Na⁺ and K⁺ channel blockers, but not as peptidase inhibitors, were also identified. The peptide DPSA8P (from Dendroaspis polylepis venom) stood out due to the fact that it had similar cathepsin L and elastase-1 inhibition on the screening step. This peptide, classified as a Kunitz one, was characterized as an incompetitive inhibitor for elastase-1, presenting a K_i of 8 µM. The docking (ZDOCK) analysis indicated interaction models of this peptide with elastase-1, in the catalytic site and in other regions of this enzyme. Using these interaction models, two peptides were designed to be studied as possible inhibitors of both elastase-1 and cathepsin L. The first one did not show inhibitory activity, however, the second, a cyclic peptide named as PEP2, which contains 30 amino acid residues, showed to be a competitive inhibitor, with K_i of 1.96 µM over cathepsin L. Furthermore, we performed re-docking analyses of the BPPs, from the Bitis spp venom, using the ACE (angiotensin converting enzyme) as receptor. These results showed high relation of the scores obtained in the in silico studies with the K_is previously determined. This work describes some low molecular weight toxins with a new function as peptidase inhibitors, and this could contribute to further understand the envenomation process. In addition, the efficiency of the docking technique to design new molecules was shown, aiming at the search molecular docking was used to the design new of peptidase inhibitors, which led to the PEP2, a peptide that is able to inhibit the cathepsin L activity with a low inhibition constant. Showing once again that this methodology may be used for the search of new biotechnological entities.